В тази втора част на статията "Топ 10 митове за HPLC и UHPLC колони" се коментират останалите 5 мита, свързани с колоните за течна хроматография, и се излагат причините за тяхната несъстоятелност.
Мит № 5: Колоните за UHPLC се запушват много по-лесно от конвенционалните HPLC колони
Погрешно: Непрестанното намаляване на размера на порьозните частици доведе до някои основни промени в дизайна на самите колони. На практика истинския виновник за нарастващото налягане не е пълнежа, а конструкцията на входящата и/или изходящата фрита. Много от проблемите с налягането, които се свързват с малкия размер на порьозните частици, всъщност се дължат на отлагането на неразтворено вещество от пробата или подвижната фаза (ПФ) върху входящата фрита. Но защо е възможно фритите да са проблемът? Когато говорим за най-използваните в практиката порьозни частици на пълнежа трябва да обърнем внимание на тяхното разпределение по размер. Когато някой си купи 1.8 µm колона, не всички частици на пълнежа и са с размер 1.8um; имаме разпределение по размер(Δdp). В долния сегмент на това разпределение може би ще има частици с размери 1.4 - 1.6um, а в горния сегмент – 2.0 - 2.2um частици. Когато се пълни колоната производителя трябва да е сигурен, че порьозността на изходната фрита е по-малка от размера на най-малките частици, които съществуват в пълнежа съгласно разпределението по размер. Ако не се спази това правило се появява възможност по-малките по размер частици да преминат през фритата или дори да се задържат в нейните пори, създавайки проблеми на по-късен етап. Трябва да се отбележи, че фритите също имат свое собствено разпределение на порите по размер и затова производителите избират фрити с порьозност от порядъка на 0.3 - 0.5um за колони с 1.8um частици. За колони с размер на частиците 3.5 - 5um обикновено се избират фрити с порьозност от 2 um, което е достатъчно за успешното задържане на пълнежа в колоната по време на нейното пълнене. Хроматографистите много рядко се оплакват от запушени фрити на 3.5 - 5um колони, освен ако не направят нещо глупаво, като например да инжектират нефилтрувани проби с високо съдържание на неразтворими частици.
Когато колоните с частици под 2um се използват при методи с превключване на колони или за обратно промиване, на входа на колоната производителя трябва да постави фрита с порьозност, която е еквивалентна с тази на изхода на колоната (0.3-0.5um). Ако потребителя инжектира нефилтрувана плазма или проби от речна вода директно в UHPLC колоните, има много голяма вероятност те да се запушат само след няколко последователни инжекции. В този случай потребителя трябва да се опита да регенерира колоната, като отмие запушването, обръщайки работната посоката на колоната (виж мит 3). Така че проблема със запушването на UHPLC колоните обикновено не се дължи на разрушен пълнеж на колоната, а на блокираните входящи фрити.
Какво може да се направи, за да се предпази входа на колоната от запушване на фритата? Съществуват няколко вида устройства, които могат да предпазят HPLC/UHPLC системата от неразтворени частици (и дори от химически замърсявания, които също могат да запушат входа на колоната). На първо място между инжектора и колоната може да се постави проточен филтър с нулев мъртъв обем (zero-dead-volume inline filter). Тези устройства имат сменяеми филтрувални фрити (0.2-0.45um), които улавят всички замърсявания, идващи от пробата и ПФ. След като този филтър се запуши (признак за това е нарастващото налягане), той може да бъде разглобен, фритата да се подмени и така, само след няколко минути хроматографската система отново може да се използва. Повечето такива проточни филтри имат много малък мъртъв обем, така че те не би трябвало да допринасят за увеличаване на извънколонните обеми. За премахване на замърсяванията може да се използва и предколона, която задържа едновременно механичните и химичните замърсители. За пречистването на пробата преди тя да се инжектира в апарата е препоръчително да се използват и различни начини за пробоподготовка, например твърдофазна екстракция, филтруване, или центрофугиране.
Мит №4: От използването на предколони няма смисъл – всъщност те влияят на разделянето ми
Погрешно: От използването на предколони следват много ползи. На първо място предколоната предпазва аналитичната колона от химично и/или механично замърсяване. Второ - подмяната на една 5mm предколона е много по-евтина от тази на скъпата аналитична колона. Модерните държатели за предколони почти нямат мъртъв обем, подмяната на филтъра става много бързо и са разработени да издържат на високи налягания в UHPLC режим. След като веднъж вече сте купили предколонния държач, самите патрончета (предколони) са сравнително евтини.
Фиг. 7: Ускорен тест: сухо бебешко мляко смесено с два фармацевтични продукта и разредено 300:1. Показаните резултати (a) без и (b) с предколона. (a) Отказ на колоната при инжекция № 70, (b) Отказ на предколоната при инжекция № 80, подмяна и продължаване на експеримента със същата колона.
Фиг. 7 подсилва твърдението, че да се използва предколона е добра идея. За да се установи колко често трябва да се подменя предколоната е проведен ускорен тест за изследване на оперативния „живот“ на една аналитична колона . Условията на теста са: сухо бебешко мляко е смесено с два фармацевтични продукта (посочени на фигурата) и разредено 300:1. Нефилтруваните проби се прехвърлят във виалки, които са поставени в автоматичен инжектор за многократното им инжектиране. В горната част на фигурата не е използвана предколона. След 85-тата инжекция се наблюдава много голямо нарастване на широчината на пиковете и за двете лекарствени вещества, дължащо се вероятно на нежелани взаимодействия между анализираните вещества и натрупаната на входа на колоната неразтворена материя от млякото. По този начин количественото определяне не е възможно. Въпреки очакваното рязко повишаване на налягането се отчита едно постепенно нарастване, вероятно поради причината, че при тези условия колоната е способна да толерира натрупването на неразтворими вещества на нейния вход. На долната графика при провеждане на същия експеримент с монтирана предколона се наблюдават същото плавно повишаване на налягането. След като предколоната е сменена, налягането се връща обратно към първоначалните си стойности, като същото важи и за широчината на пиковете. Експеримента е продължен, като се наблюдава увеличаване широчината на пиковете около 160-тата инжекция, което е индикация за натрупване на неразтворима плака от млякото върху предколоната. Така, че използването на предколони е една добра идея. Освен това съществуват и много други параметри на хроматографския анализ, които влияят върху широчината на пиковете.
Мит №3: HPLC колоните не могат да бъдат монтирани наобратно, за да се промият от замърсявания
Погрешно (понякога вярно): На практика HPLC и UHPLC колоните се пълнят при много по-високи налягания от тяхното максимално работно налягане. Ако при пълненето е използван подходящ разтворител за суспензията и подходящ хардуер, а за стабилизирането на набивката на пълнежа е отделено достатъчно време, колоната би трябвало да е използваема и в двете посоки. Освен за обратно отделяне на натрупаните върху входящата фрита замърсявания, други причини за обръщането на колоната могат да са експерименти с превключване на колоните, или за отмиване на силно адсорбирани върху пълнежа на входа вещества. В втория случай при обратното промиване силно адсорбираните на входа вещества трябва да изминат много по-къс път, за да бъдат отделени извън колоната, в сравнение с промиването на колоната без нейното обръщане.
Съществува едно изключение при обръщането посоката на потока на подвижната фаза - когато производителя е използвал фрита с по-голяма порьозност на входа на колоната и в този случай, при обръщане на колоната, е възможно да се изгуби част от нейния пълнежа. Тази възможност беше отбелязана и по-рано, при обсъждането на мит №5. Въпреки, че на изхода на колоната трябва да се използва фрита с порьозност, която е по-малка от най-малките частици от разпределението по размер Δdp, входящата фрита може да е с по-големи пори. Фритите с по-голяма порьозност (напр. 2um) имат по-голям толеранс към запушвания в сравнение с тези с по-малки пори (напр. 0.3um) и издържат повече на натрупването на неразтворими вещества . Поради тази причина някои производители използват този подход и поставят върху колоната стрелка, указваща, че колоната може да се използва само в определената посока. За да бъде сигурен, че отчита тази възможност, преди работа хроматографиста трябва да прочете упътването за работа с колоната и да отправи запитване към производителя, ако се наложи колоната да се промива в обратна посока.
Мит 2: По-малките частици и свръхвисокото налягане винаги водят до по-добро разделяне
Погрешно: Освен размера на частиците и налягането съществуват много променливи, които влияят върху ефективността на колоните, дори преди колоната да бъде поставена в апарата. Таблица III обобщава най-важните от тях.
Някои от тези параметри не могат да бъдат променяни от аналитика и е необходимо да бъдат оптимизирани при самото производство. Въпреки това, излизайки извън тези донякъде очевидни параметри, изследванията на характеристиките на съвременните колони са довели до нови подходи за това как да се направи оценка на дадена колона. Например при по-новите порьозно-слоести частици, които предлагат ефективност, сравнима с тази на под-2µm-вите UHPLC пълнежи, тяхното значително по-ниско обратно налягане затруднява конвенционалните подходи за сравнение на частиците за течна хроматография. Същото може да бъде казано за монолитните силикагел колони от второ поколение – те също генерират значително по-ниско налягане в сравнение с конвенционалните колони, напълнени с напълно порьозни микрочастици. При конвенционалните подходи за сравнение на колони, като уравнението на Ван Деемтер, уравнението за разделителната способност, фактора „импеданс на разделянето“ и т.н., не се взимат предвид всички важни параметри за сравняване на модерните колони: време, налягане и ефективност.
Така при сравняването на HPLC с UHPLC колони стават все по-популярни по-новите подходи като Poppe-диаграмите (11) и кинетичните диаграми (12). Подробното обяснение как се генерират и тълкуват кинетичните диаграми е далеч извън обхвата на тази статия и на читателя се предлагат някои отлични източници на допълнителна информация по темата (13, 14). В основни линии за създаването на кинетична диаграма може да бъде използвано уравнението на Ван Деемтер, като на фиг. 8 е даден един такъв пример. Наблюдаването на зависимостта между log t0 и log N при дадено налягане (диагоналните прекъснати линии на фиг. 8) позволява да се сравняват напълно порьозна частица (1.7–1.8 µm, червени; 3.5 µm, сини; и 5 µm, черни), порьозно-слоеста частица (2.7 µm, розови) и силикагел монолити от първо поколение (зелени). Накратко тази диаграма показва, че за бързи разделяния с висока скорост при приемлив брой на теоретичните тарелки (къси колони) порьозно-слоестите колони или тези с под-2µm пълнеж предлагат най-високата ефективност, докато колоните с по-големи частици са с по-ниска ефективност. Монолитните колони са разположени на кривата най-близко до колоните с пълнеж от 3.5 µm частици. И така – ако човек се нуждае от голям брой теоретични тарелки N и може да чака дълго време (по-ниска скорост на ПФ), тогава една 5-µm колона може да е по-добрия избор. Монолитната колона също така може да предложи най-висока обща ефективност на анализа. Кривата за молитната колона на фиг. 8 е екстраполирана, тъй като произвежданите монолитни колони се предлагат само с дължина от 10 см и техния хардуер позволява работата при налягане до 200 Bar Но ако производителите стигнат до пробив и монолитите могат да се произвеждат с по-голяма дължина и да се използват при по-високи налягания, то тогава те биха могли да бъдат най-добрия избор при трудните разделяния. За съжаление, последно представените на HPLC 2013 данни показват, че произвежданите второ поколение монолити не предлагат очакваното подобрение в тяхната позиция върху кинетичните диаграми поради тяхното високо обратно налягане , породено от промените в порьозната им структура (15).
Този прост пример показва как могат да се използват кинетичните диаграми, за да се определи най-добре работещата колона. Така че е възможно по-малките частици и свръхвисокото налягане не винаги да са най-добрия избор на хроматографиста!
Мит 1: Налягането не влияе върху разделянето в течната хроматография
Погрешно: Съществуват много изследвания, изучаващи влиянието на налягането в течната хроматография (16-23). В тези изследвания са проучвани много параметри, които са зависими от налягането, в това число частичния моларен обем на разтворените вещества, обема на подвижната фаза в колоната, порьозността на колоната, факторите на задържане, плътността на подвижната фаза, нейната диелектрична константа, структурата на неподвижната фаза, рН и йонизационните константи, а също и много други. Причината, поради която налягането привлича все повече внимание, е в появата на пазара на колони и апарати за свръхвисоко налягане. Когато колоните се използваха при около 2000 psi, малките разлики в задържането трудно се забелязваха, особено, ако даден ефект се повтаря и количественото определяне не се променя. Но когато налягането в системата наближава 20 000 psi, подобни изменения стават доста забележими.
Като извадка от най-новите изследвания за илюстриране ефектите от налягането ние избрахме проучванията на Fallas и колегите му (22,23), защото те използват последните модели UHPLC апарати и обхвати на налягането, с които в наши дни могат да се срещнат хроматографистите. В техните работи се разглежда анализ на малки (22) и големи (23) молекули. Те изследват поведението на аналитите и в неутрална (нейонизирана) и в йонизирана форма (киселини и бази), в режим на обратна фаза (С18, С1) и в HILIC режим. За да се минимизира всички възможни ефекти от фрикционното загряване на подвижната фаза, те използват колони с 5-µm частици вместо популярните под-2-µm частици, а за да генерират търсеното високо налягане, между изхода на колоната и детекторната клетка те монтират рестрикторни капилярни връзки.
Вместо да повтарям получените от тях данни, аз бих желал да дам едно обобщение на техните резултати, за да илюстрираме как влияе налягането върху задържането. За нискомолекулни неутрални съединения и подвижна фаза ацетонитрил-вода и метанол-вода, k-стойностите се променят с 12% при промяна в налягането с 500 Bar. Но трябва да се отбележи, че за повечето изследвани съединения промяната е в рамките на само 2-6%. За високомолекулни неутрални съединения се наблюдава увеличаване на задържането с над 50% (ΔP = 500 bar). Йонизираните съединения (базични и киселинни) в буферирани системи също показват увеличаване на задържането с 50% при увеличено с 500 bar налягане. Повечето от тези промени са отдавани на на намаляването на частичния моларен обем на разтворените молекули, което се случва поради премахването на техния солватационен слой чрез разпределението му в неподвижната фаза.Също така е възможно големите промени в налягането (500 bar) да повлияят върху стойностите на pKa или pH. Въпреки, че е съмнително при колко от нас налягането на колоната би се променило с 500 bar, докато разработваме метод за анализ, тези наблюдения служат за да покажат, че индуцирани от налягането промени могат да се появят в някаква степен и потребителите трябва да имат предвид тази възможност.
Фиг. 9: Селективност и налягане. (благодарение на John Dolan.)
Авторите показват примери, при които се наблюдават промени в реда на елуиране, което може да се използва като променлива при разработването на методи. Едно по-практическо следствие е, че ако конверсията на метод с по-големи частици (5-µm колона) към колона с по-малки частици 1.7–1.8 µm колона) се провежда при по-висока линейна скорост, могат да се проявят ефекти от повишеното налягане и това да доведе до отмествания във времето на задържане и дори да се промени селективността на разделянето. Фиг. 9, предоставена от Джон Долан (24), показва влиянието на налягането върху разделянето на трикомпонентна смес и как влияе увеличената скорост на потока върху налягането. В този пример, (условията на който са търговска тайна) при увеличаване на скоростта на потока налягането нараства и трите пика променят своите позиции един спрямо друг. Ясно е, че в гореспоменатите случаи налягането е имало влияние върху разделянето.
Заключение
В двете части на тази публикация бяха разбулени 10-те най-големи мита при колоните за HPLC и UHPLC, като се дадоха доказани твърдения и литературни препратки, които показват, че тези митове са неоправдани. Наоколо съществуват и много други митове, но те не влизат в челната десятка. Въпреки това, най-вероятно старите митове ще продължат да съществуват, някои от тях ще изчезнат и ще възникнат нови митове, тъй като все повече практици влизат в хроматографската общност. Това влизане на нови специалисти в общността може да доведе до преоткриване на старите митове от новите хора (тъй като те не във всички случаи слушат по-старите си колеги). Може би новите "Разбивачи на митове" ще поемат следващото поколение от митове.
Благодарности
Бих искал да благодаря на моя екип от „разбивачи на митове“, които предложиха примери или полезни предложения за 10-те най-големи мита за колоните:: David McCalley, University of Western England; John Dolan, който води рубрика в LCGC и работи в LC Resources; Lloyd Snyder, LC Resources; Peter Carr, University of Minnesota; J.J. Kirkland, AMT; Gert Desmet, Free University of Brussels; Michael Dong, който води рубрика в LCGC и работи в Genentech; Gerard Rozing, технически конултант на http://Rozing.com/; Joe DeStefano, AMT; Maureen Joseph, Agilent Technologies; и Xiaoli Wang, Agilent Technologies. Благодаря на Bill Long от Agilent, който предостави експериментални данни за някои от фигурите.
Използвана литература
(11) H. Poppe, J. Chromatogr. A 778, 3 (1997).
(12) G. Desmet, D. Clicq, and P. Gzil, Anal. Chem. 77, 4058 (2005).
(13) G. Desmet, LCGC North Am. 26 (6), 506–530 (2008).
(14) K. Broeckhoven, D. Cabooter, S. Eeltink, and G. Desmet, J. Chromatogr. A 1228, 20–30 (2012).
(15) D. Cabooter, R. Sterken, A. Vanmessen, S. Deridder, and G. Desmet, "Detailed Characterization of the Kinetic Performance of First and Second Generation Monolithic Silica Columns," presented at HPLC 2013, Amsterdam, The Netherlands, 2013.
(16) J.C. Giddings, Sep. Sci. 1, 73 (1966).
(17) N. Tanaka, T. Yoshimura, and M. Araki, J. Chromatogr. 406, 247 (1987).
(18) V.L. McGuffin and S.-H. Chen, Anal. Chem. 69, 930 (1997).
(19) V.L. McGuffin and C.E. Evans, J. Microcol. Sep. 3, 513 (1993).
(20) J.W. Thompson, T.J. Kaiser, and L.W. Jorgensen, J. Chromatogr. A 1134, 201 (2006).
(21) M. Martin and G. Guiochon, J. Chromatogr. A 1090, 16 (2005).
(22) M.M. Fallas, U.D. Neue, M.R. Hadley, and D.V. McCalley, J. Chromatogr. A 1209, 195–205 (2008).
(23) M.M. Fallas, U.D. Neue, M.R. Hadley and D.V. McCalley, J. Chromatogr. A 1217, 276–284 (2010).
(24) John Dolan, personal communication.Erratum
