Как да работим с нова колона?
И така, получили сте нова обратнофазова течнохроматографска колона. Сега какво? Почти всички колони се изпращат пълни със солвента, с който са били тествани от производителя. Това най-често е 60-80% метанол и вода. Тази подвижна фаза е съвместима с почти всяка друга използвана в обратнофазовата хроматография, така че можете да преминете директно към фазата, с която ще работите. Като допълнителна предпазна мярка, можете да измиете колоната с 20-30 mL от разтворителя, който ще използвате – метанол, ацетонитрил или тетрахидрофуран. След това преминете към подвижната фаза и колоната ще е готова за работа. Запомнете, че когато се промива или кондиционира колоната, най-важен е обема на солвента, а не времето. Следователно, ако можете да увеличите скоростта на потока, ще съкратите времето необходимо за измиване. При методи с органичен разтворител и вода или буфер 10 колонни обема би трябвало да са достатъчни за кондициониране преди работа. Колонният обем (Vm) за колона с вътрешен диаметър 4.6 mm може да се определи както следва:
Където Vm се измерва в милилитри а L е дължината на колоната в сантиметри. Следователно колона с дължина 15 cm x 4.6 mm би имала обем от приблизително 1.5 mL. Колоните с диаметър 2.1 mm имат само 20% от този обем, така че колона 5 cm x 2.1 mm би имала обем от около 100 µL.
При съвременните type-B колони с висока чистота на силика гела, възпроизводимостта е на високо ниво. Това силно контрастира с недотам чистия type-A пълнеж използван преди 15 години. Все пак много такива колони продължават да се изплзват за така наречените „legacy” методи, които се прилагат от много години при анализа на продукти и суровини. Понякога една нова колона може да има нужда от инжектиране на няколко проби, за да постигне повторимо време на задържане и площ на пика за търсения аналит. Това е все по-рядко срещано при новите видове колони, но известен период за разработване на колоната не е необичаен. Понякога това първоначално кондициониране може да се ускори чрез няколко инжекции с висока концентрация на проба или стандарт. Ако например времето на задържане или площта не са стабилни след няколко инжекции на 50 ng стандарт, може да опитате с инжектиране на 1 µg няколко пъти. След като тази проба е елуирана от колоната, опитайте отново с 50 ng. Често пъти този подоход може да ускори времето за първоначална кондициониране на нова колона.
Измиване с вода
Често чувам въпроси от сорта на: „Пробата ми е разтворима във вода, а подвижната фаза съдържа буфер и метанол. Не трябва ли да използвам вода, за да премахна всички водноразтворими замърсявания?” Отговорът ми е категорично „НЕ!” , след което обикновено чувам: „Но пробата не е разтворима в ацетонитрил.”
Има две основни причини да не мием C8 или С18 колона с вода. Първо - повечето колони не са съвместими със 100 % вода и второ – пробите са почти винаги разтворими в ацетонитрил или метанол.
Понякога описваме частиците на С18 колоната като тенис топка, при която С18 веригите се оприличават на мъхестата повърхност на топката. Това обаче не е добро сравнение. Частиците са по-скоро нещо като гъба и почти цялата контактна площ се намира в пори с диаметър от около 6-15 nm. С18 веригите са свързани вътре в тези пори и много малко от тях се намират на външната повърхностна частиците. Това прави порите много хидрофобни. При нормална работа, подвижната фаза от органичен разтворител и вода прониква в порите и напълно омокря свързаната неподвижна фаза. Аналитите трябва да навлязат навътре в порите, за да взаимодействат с неподвижната фаза и да излязат от там след времето на задържане. Когато подвижната фаза се замени с вода, тя ще проникне в порите и ще разреди органичния компонент на мобилната фаза. Но, тъй като водата е силно полярна тя не успява самостоятелно да измие свързаната фаза. Когато органичният солвент е напълно премахнат от водата, тя е толкова по-полярна от неподвижната фаза, че може да бъде изхвърлена от порите. Може да се направи сравнение с капчици вода върху мазно петно на паркинга. Когато това се случи може да миете колоната цял ден и тя няма да стане по-чиста. А когато отново се добави органичен разтворител към мобилната фаза той ще се нуждае от повече време, за да проникне и колоната ще се кондиционира по-бавно.
Този порцес на отхвърляне на водата от порите се нарича „dewetting” или буквално преведено – „размокряне”. Наричахме го колапс на фазата, но тя всъщност просто отхвърля водата от порите. Накои колони могат да бъдат омокрени със 100 % вода и те са изключение от описания принцип. Те имат добавена полярна фаза и понякога имат означение „AQ” или водно съвместими.
По-добър начин
Много по-добър подход за измиване на колоната е първо да се замени буфера на мобилната фаза с вода. Ако например работите с фаза 60:40 ацетонитрил-буфер, преминете към 60:40 ацетонитрил-вода. Измиването на колоната с 5-10 mL от тази фаза е достатъчно, за да премахне по-голямата част от буфера. След това преминете към 100% ораганичен разтворител – ацетонитрил в този случай. Промиването с 10 до 20 колонни обема с органичния разтворител би трябвало да е достатъчно, за да се отстранят силно задържащите се съединения. След това колоната може да бъде съхранена пълна с този разтворител както е свързана с хроматографската система или, ако е откачена, с тапи от двата края. Тази процедура е подходяща за всички обратнофазови колони,без значение дали са С8, С18, фенил, циано или с друга модифицирана неподвижна фаза.
Първата стъпка не винаги е задължителна ако сте работили с мобилни фази без буфер, но е добра предпазна мярка. Особено важна е когато се работи с фосфатен буфер, който не е разтворим в концентриран ацетонитрил. Не бихте искали например да преминете директно от 30:70 ацетонитрил – 20 mM фосфат към 100 % ацетонитрил, тъй като фосфатът може да преципитира и да се отложи в помпата или в колоната.
Друга предпазна мярка, която препоръчвам е да не изключвате хроматографската система за повече от час ако колоната съдържа буфер. Ако органичният компонент на подвижната фаза се изпари докато системата е изключена може да се образуват абразивни натрупвания от буфера върху буталото на помпата и други части на системата. Това ще съкрати преждевременно живота на уплътненията и може да доведе до повреди на други части от системата. По-добрият избор е да програмирате контролера да изпълни процедурата за измиване след края на поредицата от проби и преди изключването. Ако системата не разполага с възможност за такава промяна на мобилната фаза, просто задайте метод с минимална скорост на потока (например 0.1 mL/min), който да върви докато имате възможност да изпълните ръчно процедурата за промиване.
Неразтворими проби?
Няколко думи и за тезата, че пробата не е разтворима в органичния солвент на мобилната фаза. Възможно е наистина пробата да не е напълно разтворима в метанол или ацетонитрил според химичните тестове, но в концентрациите, с които се работи при хроматографските анализи е малко вероятно тя да не се разтвори. Ако пробата не се разтваря при концентрацията за анлиз, как тогава би могла да бъде елуирана от колоната по време на самия анализ? В някои отделни случаи може да съществува критична коцентрация на вода-органичен разтворител. Ако имаме успешна хроматограма, то тази концентрация вероятно е близка до използваната в мобилната фаза и тя ще успее да елуира пробата. Повечето от действията за измиване на колоната не са насочени към премахване на самата проба, а на замърсявания от матрицата достигнали до колоната. Силният разтворител на мобилната фаза е най-добрият кандидат за тази задача.
По агресивно измиване?
Понякога чувам от колеги, че обичат да промиват колоните със солвенти или разтвори, които са по-агресивни от използвания в мобилната фаза разтворител. Например след като промият с ацетонитрил, те може да продължат с метилен хлорид, метил трет-бутил етер или диметил сулфоксид. Да, те могат да премахнат някои много силно задържащи се материали, но трябва да се запитаме дали това си струва. От икономическа гледна точка един нормален LC-UV анализ струва от порядъка на $50 във фармацевтичната индустрия. Ако една аналитична колона за $500 издържа около 500 инжекции, то това е по $1 на проба или 2% от общата стойност. Ако можете да отделите час за допълнително почистване на колоната и успеете да удвоите живота ѝ, то сте спестили 1% от цената за анализ. Дали това е добра инавестицияна време? Аз смятам, че ако колоната издържа над 500 инжекции съм получил добра стойност от нея. А в моята практика, дори при сложни матрици, колоните често издържат и до 2000 инжекции. Все пак да не забравяме, че аналитичните колони са консуматив, дори и да са скъпи.
Следващият анализ...
Ако винаги приключвате работа като измивате и съхранявате колоната с разтворителя от мобилната фаза, то следващата подготовка за работа е много лесна. Знаете, че колоната е промита със силен органичен разтворител, така че всички силно задържащи се материали би трябвало да са измити от колоната. За последваща употреба е достатъщно да преминете към мобилната фаза и да изчакате колоната да се кондиционира – обикновено 10-20 колонни обема са достатъчни. Ако не сте сигурни дали колоната се е кондиционирала, направете няколко последователни инжекции на стандарт. Ако времената на задържане на две последователни проби са еднакви, то колоната е кондиционирана.
И няколко думи от спонсорите
Всяко обсъждане относно миенето на колоните би било недовършено без думите: „Ако всичко друго се провали, прочетете упътването.” Всяка колона се изпраща с инструкция за употреба и грижа. Ако не можете да я откриете, то би трябвало да е публикувана на уеб страницата на производителя. Тези инструкции обикновено съдържат препоръчителните условия за експлоатация, pH обхват, разтворители, които не бива да се използват, процедури за почистване и съхранение. Процедурите, които вече разгледахме, би трябвало да са приложими за почти всички обратнофазови колони със силика гел. Хиралните колони, тези които използват полимери вместо силика, някои правофазови и специални колони може да имат различни ограничения за приложимите разтворители и процедури за почистване. При всички случаи инструкциите на производителя следва да бъдат съблюдавани.
Заключение
Направете ваша стандартна практика измиването на подвижната фаза от колоната и съхранението ѝ в 100% от използвания ата органичен разтворител. Този органичен разтворител можете да използвате за подготовка на нова колона, измиване на силно задържащи се материали и за съхранение. Ако всичките ви колони са съхранени в метанол, ацетонитрил или тетрахидрофуран лесно ще ги подготвяте за нова работа. Просто пуснете мобилна фаза през системата и оставете колоната да се кондиционира с 10-20 колонни обема (15-20 минути при 1-2 mL/min поток са достатъчни). После проверете дали колоната е кондиционирана с две последователни инжекции на стандарти. Ако времената на задържане и площта на пиковете съвпадат, колоната е готова за анализ на нови проби.
Източник:
August 1, 2008
John W. Dolan
LCGC North America, LCGC North America-08-01-2008, Volume 26,Issue 8
