Роналд Мейджърс

LCGC North America / Volume 31, Issue 7 / 22. 08.2013

Речника Webster's New Collegiate Dictionary дефинира думата мит като "необосновано вярване, прието безкритично, особено от заинтересована група". Възможно ли е, това да бъде група от неинформирани хроматографисти? В статията на Рон Мейджърс са представени топ 10 митовете, свързани с колоните за течна хроматография, като се правят опити тези митове да бъдат демистифицирани, предлагайки някои доказателства за тяхната неистинност. Тази първа част включва митове от номер 10 до номер 6.

Във всяка една област се срещат често "заблуди" или "митове", които се запазват и предават на следващите поколения. Съществуването им често се дължи на липсата на разбиране на истинските проблеми от страна на практикуващите. Тези митове също така могат да претърпят промени с течение на времето. Преди седем години в серията публикации "Column Watch" (1) бяха демистифицирани 10-те най-популярни към онзи момент митa за колоните за високоефективна течна хроматография (HPLC). Тъй като високоефективната течна хроматография наближава своята 50-годишнина, много митове за колоните вече са преминали през две поколения хроматографисти. Наскоро се утвърдиха и приложенията на свръх-високоефективната течна хроматография (UHPLC), което води до появата на нови „митове“. Целта на тази част от сериите "Column Watch" е да се преразгледа и актуализира информацията на читателите относно най-популярните съвременни митове за хроматографските колони, както и да се опитаме да разсеем някои от тези митове, преди те да се утвърдят. Публикацията е адаптация на презентация, която беше представена на HPLC 2013 в Амстердам (2). Съгласно подхода с "обратното броене“ ще започнем с номер 10 и ще продължим нагоре до мит Номер 1.

 

Мит 10: Въздуха „убива“ колоните за течна хроматография

Погрешно: Обикновено HPLC и UHPLC колоните се доставят запушени с полимерни капачки в двата края. На потребителите се указва винаги да запушват плътно колоните, след като бъдат деинсталирани от апарата. Идеята е, че в колоната могат да навлязат големи количества въздух, които биха могли да повредят пълнежа, да доведат до появата на мехурчета в детекторната клетка при следващо инсталиране върху HPLC апарата и евентуално да разрушат морфологията на набивката на пълнежа. Първо - човек трябва да осъзнава, че тясната дупчица в крайните фитинги е по-малка от 0,5 мм и по тази причина има съвсем малко напречно сечение. Ако колоната бъде оставена отворена, малкото количество въздух, което навлиза в нея през крайния фитинг, трудно би могло да причини непоправима повреда. В зависимост от летливостта на разтворителя, който се използва за съхранение на колоната, би могло да се наблюдава някакъв процес на изпаряване близо до краищата и. Но ще е трудно по-големи количества въздух да навлязат през микрочастиците в пълнежа, като се има предвид голямото налягане, което е необходимо да бъдат придвижени течни подвижни фази през фината структура му структура. Малкото количество въздух, който евентуално може да влезе в краищата на колоната, ще бъде веднага разтворено, когато системата бъде поставена под налягане, и най-малкото може лесно да бъде изхвърлено от колоната при подаване на налягане за кратко време, като тази процедура не би довела до проблеми с хроматографията по-късно. Все пак, чрез запушването на колоните при тяхното съхранение се избягва и навлизането на твърди частици от работната среда или материалите на опаковката. Във всеки случай, ако забравите колоната без запушени вход и изход, това вероятно няма да я повреди, но запушването е част от добрата грижа за нея.

 

Мит 9: Всички C18 (L1) колони са еднакви

Погрешно: Всички наши обзори на HPLC колони до момента показват, че като предлагане и употреба С18 е най-популярната свързана фаза (3). Тъй като производителите на лекарства са най-ранните потребители на HPLC, специалистите на US Pharmacopeia (USP), без да искат да фаворизират някой производител на HPLC колони, разработили система за класификация за всеки тип колона със свързана фаза, която е приета за анализ на дадено ново лекарство. За HPLC колоните обозначението е с буквата "L", и тъй като C18 се използвала в повечето методики на производителите, нейното означение било "L1." След навлизането в практиката на други свързани фази, на тях също били дадени техни "L" номера, напр. C8 (L7), CN (L10), phenyl (L11), и т.н. Усложнението с тази система идвало от факта, че всяка нова С18 колона, на практика се приемала за L1 и се считала за еквивалентна на останалите L1 колони. За съжаление тази система е доказано ненадеждна, тъй като колоните на различните производители, произведени от различни базови силикагели и обработени с различни силанови реагенти чрез различни схеми на синтез, от хроматографска гледна точка не са еднакви, и поради това не са еквивалентни. Понастоящем с повече от 800 различни L1 колони на пазара, системата на USP се е доказала като меко казано объркваща.

Фиг. 1: Хроматограми, получени при използването на  HPLC колони с един и същ силикагел носител, но с различно химично свързване на C18 фазата: (a) Zorbax Eclipse Plus C18 (различно третиране на повърхността на пълнежа, един и същ силикагел-носител, двойно деактивиране, един и същ механизъм на свързване като при Eclipse XDB-C18), (b) Zorbax StableBond SB-C18 (един и същ силикагел-носител, стерично предпазена C18 фаза, без деактивиране), (c) Zorbax Eclipse XDB-C18 (един и същ силикагел-носител, мономерно свързване на С18), двойно деактивиране), (d) Zorbax Extend-C18 (един и същ силикагел-носител, бидентатно свързване на С18, двойно деактивиране). Размери на колоните: 50 mm × 4.6 mm ID, 1.8-μm; подвижна фаза: 69:31 ацетонитрил - вода; скорост на потока: 1.5 mL/min; температура на колоната: 30 °C; детектиране: масспектрометър с единичен квадрупол и ESI йонизация, режим positive scan. Пикове: 1 = anandamide, 2 = palmitoylethanolamide, 3 = 2-arachinoylglycerol, 4 = oleoylethanolamide.

Предложени са няколко подхода за по-детайлна класификация на обратнофазови колони за течна хроматография, включително модела на хидрофобно изключване (hydrophobic subtraction model (4,5)), но и днес "L" класификацията е широко разпространена в хроматографската практика. Поради тази причина някои хроматографисти, които нямат задълбочено разбиране за проблематиката, все още вярват, че „всички C18 колони са едни и същи“. На фиг. 1 и фиг. 2 са показани прости примери, че случая не е такъв. На фиг. 1 са показани хроматограми от 4 различни С18 колони, за едно и също разделяне при едни и същи условия, като всяка хроматограма е различна.

 

 

Фиг. 2: Разделяне на една и съща тестова проба върху три обратнофазови колони при едни и същи условия: (a) Ace C8 (Advanced Chemical Technologies), (b) Precision C8 (Mac-Mod), (c) Inertsil C8 (GL Sciences). Размери на колоните: 15 cm × 4.6 mm ID; скорост на потока: 2.0 mL/min; температура: 35 °C; подвижна фаза: 50:50 30 mM калиево-фосфатен буфер (pH 2.8)–ацетонитрил. Пикове: 1 = N,N-diethylacetamide, 2 = nortriptyline, 3 = 5,5-diphenylhydantoin, 4 = benzonitrile, 5 = anisole, 6 = toluene, 7 = cis-chalcone, 8 = trans-chalcone, 9 = mefenamic acid. (С любезното съдействие на Лойд Снайдер и Джон Долан, LC Resources.)

 

 

 

За да демонстрираме, че “L” класификацията не работи и за други свързани фази, фиг. 2 предлага пример с три различни C8 (L7) колони. Едната от хроматограмите (фиг. 2b) е много подобна на оригиналната хроматограма и вероятно би могла да бъде подходяща за HPLC метода, но третата колона (фиг. 2с) показва доста различно разделяне и дори може да бъде определена като ортогонална на първите две колони. Означението F на всяка хроматограма е числена класификация за това колко подобни са колоните една с друга (4,5). Близки F – стойности могат евентуално да се заменят една с друга, докато големи стойности на F предполагат, че колоната не може да бъде заместител на референтната в даден HPLC метод. На практика, такава колона може да бъде подходяща в случай, че се извършва първоначално разработване на метода, тъй като тя предлага различна селективност в сравнение с другите колони. В заключение може да кажем: C18 (L1) и другите колони с едни и същи свързани фази не са еднакви.

 

Мит 8: Никога не използвайте 100% вода или буфер с обратнофазова ТХ колона

Погрешно: Този мит идва от потребители, които са се срещали с един феномен, известен като „колапс на фазата“, който се наблюдава при колони с обърната фаза и използване на подвижна фаза с нисък процент на органичен разтворител или 100% вода (буфер). „Колапс на фазата“ е всъщност погрешен израз, тъй като явлението се обяснява по-добре като „изсъхване“ на свързаната фаза. „Изсъхването“ на свързаната фаза е силно нежелано, тъй като времената на задържане намаляват и не са възпроизводими. Формата на пиковете може да бъде нарушена, а времената за стабилизиране на колоната могат да бъдат доста дълги. По-рано авторите публикуваха две детайлни статии на тази тема (6,7). Условия за „изсъхване“ най-често възникват, когато потребителите се опитват да увеличат задържането на много полярни съединения в режим на обратна

фаза, намалявайки съдържанието на органичен разтворител. В наши дни този проблем често се решава чрез използване на течна хроматография с хидрофилно взаимодействие (HILIC).

Ще се опитам да обясня явлението „изсъхване“ на свързаната фаза с помощта на фиг. 3. На нея са показани два случая. При ситуация A в подвижната фаза има значително количество смесващ се с вода органичен разтворител, като метанол или ацетонитрил, а химично свързаните нагъсто С18 вериги (или друга хидрофобна свързана фаза) предпочитат да бъдат солватирани с органичен разтворител (да си спомним за правилото подобни се разтварят в подобни). В ситуация B подвижната фаза има много ниско съдържание на органичен разтворител ( <10%) или дори съдържа 100% вода. В горната част на фиг. 3 може да бъде наблюдавана една много опростена визуализация на „изсъхване“ на свързаната фаза. При ситуация А е показано как свързаните неполярни C18 групи са солватирани с метанол и в такова състояние са способни да участват в хидрофобни взаимодействоя с хидрофобните части на анализираните молекули, по този начин осигурявайки задържането им в колоната. От друга страна, в горната дясна част на фиг. 3, за ситуация В, се вижда какво е състоянието на С18 веригите в неподвижна фаза, състояща се от 100% от вода. Функционалните C18 вериги предпочитат да бъдат в самоасоциирано състояние (по правилото подобни се разтварят в подобни) и се навиват около себе си. Долната част на фиг. 3 показва нагледно какво всъщност се случва. Тъй като повечето от взаимодействията с неподвижната фаза се осъществяват вътре в порите на частиците (а не на повърхността), когато в подвижната фаза присъства органичен разтворител (повече от 10%), порите са пълни с водноорганична смес, която позволява солватацията на С18 групите и всичко протича нормално. Когато обаче разтворителя в порите стане „недружелюбен“ (напр. много ниско съдържание на В или 100% А), се появява тенденция към изтласкване на водата вън от порите на сорбента, което води до явлението „изсъхване“. Това изсушаване не се случва веднага, а постепенно, и като резултат задържането на органичните съединения и съответно техните времена на задържане могат да намалеят. Селективността също може да се промени, а формата на пиковете да се влоши.

„Изсъхването“ на свързаната фаза най-често се наблюдава при много хидрофобни, много плътно свързани неподвижни фази. Фазите, които са силно деактивирани с неполярни силанови реагенти, могат да подпомогнат явлението. Процентното съдържание на органичен разтворител, при което започва да се наблюдава изсушаване, варира с изменението на голям брой параметри на разделянето като тип на свързаната фаза, плътността на свързване на функционалностите, размер на порите, присъствието и достъпността на свободни силанолни групи на повърхността на силикагелните частици на пълнежа. „Изсъхването“ на свързаната фаза не поврежда необратимо колоната и тя може да бъде възстановена по начините, описани по-долу. Въпреки това, в течение на много години, течните хроматографисти са били напълно объркани при появата на това явление. Много време е било изгубено в опити да разреши проблема с променените  времена на задържане. От тук следва и убеждението на много аналитици, че човек не би трябвало да работи на колони с обърната фаза в силно водна среда.

Има три подхода за преодоляване „изсъхването“ на свързаната фаза: 1) да се подложи колоната на високо налягане съгласно уравнението на Laplace-Young (вж. в реф. 6 пример за този подход) и 2) да се ресолватира неподвижната фаза с по-високо съдържание на органичен разтворител в подвижната фаза.

Първия подход е доста неудобен и изисква да бъдат проведени голям брой експерименти за откриване на правилното налягане. Втория подход е далеч по-лесен за изпълнение, тъй като колоната вече е инсталирана в апарата и експерименталните условия могат да бъдат нагласени, така че в елуента да присъства достатъчно количество за ресолватиране на свързаната фаза. Третия подход, разбира се, е да се използва колона със свързана фаза, която е солватирана при всеки състав на подвижната фаза (вж. по - долу).

Figure 4: Непостоянно задържане при подвижна фаза с високо съдържание на вода – разделяне на прокаинамиди върху хидрофобна C18 колона. Последователност на експериментите: кондициониране с 50:50 смес от фосфатен буфер и ацетонитрил за 15 мин; пропуска се подвижна фаза за 5 мин.; инжектиране на пробата и е получена хроматограмата, показана на: (a); превключваме на 100% буфер за 30 мин., обратно превключваме на подвижна фаза за 5 мин., инжектираме пробата отново и получаваме хроматограма (b); повтаряме първите 3 стъпки и вида на хроматограмата се връща на (a). Колона: 150 mm × 4.6 mm Eclipse XDB-C8; подвижна фаза: 90% 50 mM KH₂PO₄ (pH 3.5), 10% ацетонитрил; скорост на потока: 1.0 mL/min; стайна температура на колоната. Пикове: 1 = uracil, 2 = procainamide, 3 = N-acetylprocainamide, 4 = N-propionylprocainamide, 5 = caffeine.

 

За да илюстрираме какво може да се случи в условията на фазово „изсъхване‘, на фиг. 4 е даден пример с разделяне на прокаинамиди върху много хидрофобна С8 фаза. Последователността на експериментите е дадена в описанието на фиг. 4. Фиг. 4а представлява нормалното изократно разделяне, което се извършва, след като неподвижната фаза е солватирана със смес от ацетонитрил – буфер. След това подвижната фаза е променена на 90% NH₄H₂PO₄ – буфер и 10% ацетонитрил, което също позволява солватиране на хидрофобната неподвижна фаза. На следващия етап колоната се промива за определен период от време с буфер (без органичен разтворител). След това подвижната фаза се връща към първоначалните условия и пробата отново се инжектира. Забележете силно скъсените времена на задържане и промяната в селективността, които се наблюдават на фиг. 4b. Ясно е, че това разделяне е различно от това, което се очаква. Промиването на колоната с вода води до промяна в характеристиките на неподвижната фаза по отношение на задържането, причинена най-вече от явлението „изсъхване“ на свързаната фаза. След това колоната е промита със смес от 50 обемни процента воден буфер и 50 обемни процента ацетонитрил, последвано от подвижна фаза. Тази поредица от действия довежда до връщане в първоначалния вид на хроматограмата от фиг. 4a.

Таблица I представлява списък с неподвижни фази, с които не се наблюдава явлението „изсъхване“ на свързаната фаза. Всички тези фази имат някакъв вид полярна функционална група, която е свързана химически в свързаната фаза или близо до нея. Фазите с включена полярна група са сред най-популярните от този вид специални фази. При тях полярната функционална група е разположена върху самата свързана фаза, като обикновено се премахват няколко въглеродни атома след връзката на въглеводородната верига със силикагелната повърхност. При различните фази, които се предлагат на пазара, се използват различни включени функционални групи, като най-използваните са амидна, уреа и карбаматна група. Благодарение на наличието на тези групи, водата в подвижната фаза вече може да солватира свързаните неполярни фази и така да не се осъществява колапс или „изсъхване“. Някои колони имат полярни функционални групи, които са включени по друг начин, като деактивиране на остатъчните силанолни групи с полярни функционалности (напр. диол). Тези фази обикновено се означават от производителите като AQ – тип. Фазите с много къси ВВ вериги (напр. С2) не показват ефекта на изсушаване на свързаната фаза, тъй като пространствено те позволяват формирането на водородни връзки между остатъчните силанолни групи и водните молекули от ПФ. Изненадващо фазите с много дълги ВВ вериги също не проявяват ефекта на изсушаване, и то най-вече защото стеричното пречене при свързването им към силикагелната повърхност позволява да останат достатъчно свободни силанолни групи, с които водата в ПФ да взаимодейства и повърхността да бъде солватирана. При фази с голям диаметър на порите също не се наблюдава изсъхване на свързаната фаза, тъй като порите на частиците са достатъчно големи, за да не могат капилярните сили да изтласкват водата извън тях.

Фиг. 5: Стабилно задържане на прокаинамиди. Последователност на експериментите:  retention of procainamides. Последователност на експериментите: кондициониране с 50:50 смес от фосфатен буфер и ацетонитрил за 15 мин; пропуска се подвижна фаза за 5 мин.; инжектиране на пробата и е получена хроматограмата, показана на: (a); превключваме на 100% буфер за 30 мин., обратно превключваме на подвижна фаза за 2 мин., инжектираме пробата отново и получаваме хроматограма (b). колона:  150 mm × 4.6 mm, 5-μm Zorbax SB-Aq; подвижна фаза: 90% 50 mM KH₂PO₄ (pH 3.5), 10% ацетонитрил; скорост на потока: 1.0 mL/min; стайна температура на колоната. Пикове: 1 = uracil, 2 = procainamide, 3 = N-acetylprocainamide, 4 = N-propionylprocainamide, 5 = caffeine.

Фиг. 5 показва използването на фаза от AQ-тип при условия, в които подвижната фаза съдържа нисък процент органичен разтворител. Последователността на експериментите с тази колона е много подобна на тази от експериментите на фиг. 4, тъй като тази неподвижна фаза е разработена за работа с ниско съдържание на органика в елуента (или 100% вода) и тя не търпи изсушаване на свързаната фаза, когато се използва при същите условия като силно неполярната фаза от фиг. 4. Такива фази се препоръчват за разделяне на полярни съединения с малка молекула, която се задържат слабо върху повечето обратнофазови хроматографски колони.

Мит 7: Необходими са минимум 10 колонни обема ПФ за рееквилибриране на колоната

Погрешно: Времето за рееквилибриране е много важно в градиентната хроматография, тъй като е ограничителен фактор за производителността на анализа. При приключване на градиентната програма, колоната трябва да бъде върната в нейното начално състояние, преди да бъде направено следващото инжектиране. Колкото повече време е необходимо, за да се случи това възстановяване, толкова по-дълго е времето на всеки отделен аналитичен ход. От друга страна при залагането на повече от необходимото време, хабим неоправдано разтворителите. В модерната двудименсионална течна хроматография (2D LC×LC), производителността се определя от скоростта на анализа върху втората колона, тъй като потока през първата колона не спира, докато тече анализа върху втората колона. Ако за еквилибриране на втората колона са достатъчни 10 колонни обема вместо само няколко, тогава подробната 2D-хроматография, която по принцип е бавен процес, става още по-бавна. А ако времето за еквилибриране е прекалено малко и колоната не се стабилизира добре, тогава се влошава възпроизводимостта на времената на задържане, а тя е важна особено когато времето на задържане се използва за идентифициране на анализираните съединения.

В специализираните издания има много голям брой статии, чиято тематика е изучаването времето за рееквилибриране, но в настоящата работа ще си позволим да цитираме две от тях, написани на най-достъпен език (8,9). Schellinger, Stoll, и Carr (8) изучават високоскоростно, градиентно разделяне на неутрални и базични съединения с буферни елуенти в режим на обратнофазова течна хроматография, за определяне на репродуктивноста и рееквилибрирането на системата, последвано от изучаването и постигането на условия за пълно равновесие (9). Променливите, които допринасят за проблемите при достигане на рееквилибриране в обратнофазовата ТХ, са много. В изократен режим течната хроматография не се нуждае от време за достигане на равновесие на началните условия при всяко следващо инжектиране, но може би е необходим известен период от време, ако трябва да променим състава на фазите. При градиентната хроматография роля играе както състава на фазите, така и типа свързване на неподвижната фаза, дизайна на самия ТХ апарат (неговия мъртъв обем), скоростта на потока, типа на разтворените във фазата вещества (йонни, неутрални и т.н.), използването (или неизползването) на добавки към подвижната фаза.

Сега ще обобщим всички най-важни неща, известни за рееквилибрирането. Първо трябва да извадим така важния за аналитика мъртъв обем на апарата от общия преминал през колоната обем, защото той няма нищо общо с времето за рееквилибриране. По-рано хроматографистите са се сблъсквали с мъртъв обем от порядъка на няколко милилитра, който представлява сумарния обем от точката на смесване на разтворителите в смесителя на помпата до входа на колоната. През колоната трябва да преминат много обеми подвижна фаза, преди истинския градиентен състав да достигне колоната. Ако помпата смесва разтворителите при високо налягане, съществено значение за постигане на добро смесване имат обемите (и конструкцията) на: смесителя, дегазера, датчика за налягането, всички капиляри, които свързват инжектора с пробовземащата капиляра и крановете на инжектора с колоната. Когато за градиентна хроматография се използват помпи със смесване при ниско налягане, значение имат обемите на пропорциониращия модул, входящия и изходящия клапан, буталото (буталата) на помпата и всички свързващи капиляри. При новите UHPLC системи мъртвия обем е драстично намален с няколко порядъка, което съответно намаля и обема, необходим за рееквилибриране на системата.

Няколко са важните заключения, които може да се направят от проучването за рееквилибриране на системата. Има два типа рееквилибриране: повтарящо се равновесие и пълно равновесие. Когато имаме повтарящо се равновесие, системата ни може и да не достига до пълно равновесие, но на практика, ако имаме достатъчно добра повторяемост на резултатите при последователно инжектиране и тя е по-малка от 0,002min, то тогава за нейонизиращи се съединения в елуенти без буфери и за базични съединения при използване на популярните трифлуороцетна и мравчена киселина необходими за достигане на равновесие са само два колонни обема. При недеактивирани фази е препоръчително добавянето на 1% бутанол към подвижната фаза за постигане на пълно равновесие след два колонни обема. При деактивираните фази бутанола не се отразява така благоприятно.

 

Мит 6: Порьозно-слоестите частици имат значително по-малък капацитет към количеството нанесена проба

Когато става въпрос за сравнение с изцяло порьозните частици, едно такова твърдение е погрешно. Капацитета на пълнежа по отношение на количеството нанесена проба е пропорционално на наличната активна повърхност, която пък от своя страна е пряко свързана с количеството на мономерно свързаните въглеводородни вериги към свободните силанолни групи. Ако човек направи математически изчисления за сравнение на обема при 2.7-μm напълно порьозни частици (ТРР) и този при 2.7-μm порьозно-слоести частици (SPP) с 0.5-μm порьозен слой, ще се установи, че обема при SPP частиците е с 25% по-малък от този при TPP. При този подход се предполага, че двата вида частици имат еднакви характеристики на порьозната част, което може и да не е вярно. Ако специфичната повърхност при SPP е по-голяма от същата за TPP, то тогава разликата в капацитета на двата пълнежа по отношение на количеството нанесена проба би трябвало да е още по-малка.

Вместо да се разчита на математически допускания, ние проведохме експерименти, сравняващи капацитета на двата типа пълнежи за базични съединения при еднакви хроматографски условия. Върху четири колони са инжектирани по-високи концентрации на базичното съединение декстрометорфан. Три от колоните са с порьозно-слоести частици - Poroshell 120 EC-C18 (100 mm × 3.0 mm, 2.7-μm, Agilent Technologies); Ascentis Express C1 8 (100 mm × 3.0 mm, 2.7-μm, Sigma Aldrich/Supelco); & Kinetex C18 (100 mm × 4.6 mm, 2.6-μm, Phenomenex). Колоната с напълно порьозни частици е Zorbax Eclipse Plus C18 (100 × 3.0 mm, 1.8-μm, Agilent Technologies).

Фиг. 6: Инжектиране на базично съедининение (декстрометорфан) върху 2.7- и 2.6-μm порьозно-слоести и 1.8- μm напълно порьозни частици. Увеличение в широчината на пика от 10%  за порьозно-слоестите колони се наблюдава при горе-долу същото претоварване, както и при колоната с напълно порьзни частици. Подвижна фаза: 80% 25 mM Na2HPO 4 буфер (pH 3.0), 20% ацетонитрил; Детектиране: UV при 205 nm; Температура: 30 °C. Колони: сини ромбове: 100 mm × 3.0 mm, 2.7-μm Agilent Poroshell 120 EC-C18; оранжеви квадрати: 100 mm × 3.0 mm, 2.7-μm d p Supelco Ascentis Express C18; зелени триъгълници: 100 mm × 4.6 mm, 2.6-μm d p Phenomenex Kinetex C18; жълти X-ове: 100 mm × 3.0 mm, 1.8-μm d p Agilent Zorbax Eclipse Plus

Една от дефинициите за претоварване на колоната е намалението с 10% на хроматографската ефективност, което се причинява от количеството на инжектираната проба (или увеличаване с 10% ширината на пика). На фиг. 6 е представена зависимостта на ширината на пика от концентрацията на инжектирана проба при еднакъв обем на инжектиране. Ясно се вижда, че имаме еднакво увеличение на ширината на пика при концентрации от 0.05 mg/mL както за порьозно-слоести частици, така и за напълно порьозните частици (увеличение на ширината с 10%), което показва еднакъв капацитет на двете колони. В подобно изследване Fallas и колеги (10) достигат до същите заключения. В табл. II са представени резултати от техните изследвания. Изводът от тях е, че за базични и киселинни съединения Poroshell 120 EC-C18 и напълно порьозната Zorbax Eclipse Plus C18 колони, при еднакви параметри и условия, показват приблизително еднакви резултати за капацитета на колоните по отношение на количеството нанесена проба. В изследването са включени и други колони, като резултатите при тях са много близки до представените в таблицата. Въпреки това при новите колони, при които порьозния слой е още по-тънък, може да има съществена разлика в капацитета за порьозно-слоестите и напълно порьозните частици.

Използвана литература:

(1) R.E. Majors, LCGC North Am. 24 (11), 1172–1182 (2006).

(2) R.E. Majors, "Top Ten LC Column Myths, Lecture PL2" presented at HPLC 2013, Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands, 2013.

(3) R.E. Majors, LCGC North Am. 30 (1), 20–34 (2012).

(4) L.R. Snyder and J.W. Dolan, LCGC North Am. 22 (12), 1146–1152 (2004).

(5) L.R. Snyder and J.W. Dolan, LCGC North Am. 23 (2), 118–127 (2005).

(6) M. Przybyciel and R.E. Majors, LCGC North Am. 20 (6) 516–523 (2002).

(7) R.E. Majors and M. Przybyciel, LCGC North Am. 20 (7), 584–593 (2002).

(8) A.P. Schellinger, D.R. Stoll, and P.W. Carr, J.Chromatogr. A 1192 (1), 41–53 (2008).

(9) A.P. Schellinger, D. R. Stoll, and P.W. Carr, J.Chromatogr. A 1192 (1), 54–61 (2008).

 

Роналд Мейджърс е редактор на рубриката на LCGC "Column Watch" и старши изследовател в звеното за колони и
консумативи на Agilent Technologies, и също така е член на консулатативния съвет на редакторите на списание LCGC.