1. Измервате рН на подвижната фаза след прибавянето на органичния компонент
pH – метрите са калибрирани, за да отчитат правилно стойността на рН във водни разтвори, и буферите, с които ги калибрирате, също са водни. Ако измерите рН на подвижната фаза след прибавянето на органичния разтворител, то тази стойност ще бъде различна от тази, която ще получите, ако измерите рН само на водния буфер.
Въпреки това, най-важно е измерването да се прави при едни и същи условия. Ако винаги измервате рН след прибавянето на органичния разтворител, уверете се, че сте упоменали това в методиката, така, че всеки, който я прилага, да измерва рН на подвижната фаза при същите условия. Стойността, която отчита рН – метъра, няма да е точна, но най-малкото ще бъде определяна при едни и същи условия. Може би това е по-важно, отколкото да знаете истинската стойност на рН.
2. Не използвате буфер
Буферите се използват, за да се контролира рН на подвижната фаза и за да я направят устойчива към промяна на рН. Много други параметри на аналитичния метод могат да променят рН на подвижната фаза (напр. матрица на пробата, CO2 във въздуха, източника на вода за вашата подвижна фаза) и по този начин да станат причина за отмествания в задържането, формата на пиковете и тяхната височина.
Мравчената киселина, трифлуороцетната киселина (TFA) и т.н. не са буфери!
3. Не използвате буфера в неговия правилен рН обхват
Всеки буфер има работен обхват от 2 pH единици (pKa стойността му ± 1), в който осигурява оптимална стабилност на рН. Извън този прозорец солта на буфера е неефективна за поддържане на постоянно рН при настъпване на промени. Поради тази причина или трябва да използвате буфера в неговия правилен обхват, или да изберете буфер, който е ефективен в желаната от вас стойност на рН.
4. Прибавяте буфер към органичния компонент на подвижната фаза
Приготвяне на подвижна фаза, при което се прибавя воден буфер към органичен разтворител, носи голям риск от преципитиране на буфера – в много от случаите получаващите се кристали от солта са толкова фини, че може да не се виждат с просто око и аналитика да приеме, че смесването е протекло нормално.
ВИНАГИ прибавяйте органичния разтворител към водната част от подвижната фаза, това силно намалява риска от преципитиране.
5. Използвате помпата на системата за смесване от 0% при градиенти
Модерните HPLC помпи са много ефективни при смесването на подвижните фази и дегазирането в реално време и все пак едва ли всеки, който ще използва вашия метод, би разполагал с висококачествена помпа. Смесвайте предварително вашата стартова подвижна фаза в един разтвор, който в началото на градиентната програма да бъде въвеждан 100% от един канал (напр. канал B).
Например ако вашата градиентна програма стартира със състав 95 % воден разтвор и 5% органичен разтворител, пригответе стартовата смес от 950 mL воден разтвор и 50 mL органичен разтворител, след това филтрувайте и дегазирайте. Това намалява вариацията между отделните HPLC системи, на които ще бъде работен метода, а също така намалява риска от образуване на мехурчета в подвижната фаза и възможността за преципитиране на солта от буфера. Вземете предвид, че подвижна фаза 95:5, която е смесена чрез помпата, няма да даде съвсем същото време на задържане като същата подвижна, но смесена предварително – обикновено трябва да прибавите няколко процента органика повече, когато смесвате предварително.
6. Не използвате правилната киселина или основа, когато нагласяте рН на вашия буфер
Използвайте само киселина или основа, която образува солта във вашия буфер. Например рН на буферите от натриев фосфат трябва да бъдат нагласяни само с фосфорна киселина или натриева основа.
7. Не посочвате пълната информация за приготвянето на вашия буфер (напр. „Претеглете 5г. натриев фосфат и го разтворете в 1000mL вода")
Типа на буферната сол (моно-, ди-, или трибазична) определя рН обхвата на буфериране.
Заложената моларна концентрация (mol/L) е параметъра, който определя силата на буфера. 5g безводен натриев фосфат и 5g натриев фосфат монохидрат, разтворени в едно и също количество вода, ще имат различна буферна сила и това може да повлияе на задържането.
8. Пълните входящите линии на помпата с органичен разтворител, без да проверите какво е имало преди това в тях
Ако при предишния аналитичен метод се използва буфер в канал B на помпата, а в метода, който ще използвате вие, е заложено 100% органичен разтворител в канал В, се появява отлична възможност буфера, който е останал в помпата от предишната работа, да преципитира (в захранващите помпата линии или в самата глава на помпата. Ако не сте съвсем сигурни – промийте линиите и помпата с 80:20 вода : органичен разтворител.
9. Подпирате бутилките с подвижна фаза настрани, за да използвате и последните капки
Часа е 5 без 5 и вие разбирате, че едва ли имате достатъчно подвижна фаза, за да завършите анализа – последните няколко проби ще минат на „изпарения“. Освен риска да позволите помпата и колоната ви да работят на сухо, подвижните фази се изпаряват на повърхността на течността и техния състав близо до повърхността не е съвсем същия като този във вътрешността на бутилката. Тази част от подвижната фаза, която е на повърхността и е с леко променен състав, е точно това, с което ще хроматографирате вашите последни няколко проби, ако използвате последните капки от бутилката, и това може да доведе до отклонения в качеството на разделянето.
10. Използвате ултразвук за дегазиране на подвижната фаза
Използването на ултразвуковата вана е чудесно средство, за да сте сигурни, че всички буферни соли в подвижната фаза са се разтворили напълно, но от друга страна това е най-неефективния метод за дегазиране. Освен това използването на ултразвук води до бързо загряване на подвижната фаза и оттам до по-интензивно изпарение на органичния компонент в нея. Предпазете себе си от проблеми по-късно – отделете 5 мин., за да филтрувате вашата подвижна фаза под вакуум – така едновременно я филтрувате и дегазирате достатъчно ефективно.
