Защо рН е важен параметър в течната хроматография?
За някои хроматографски разделяния ефекта от промяната на рН на подвижната фаза е минимален. Но за киселинни и базични молекули ефекта върху разделянето дори при малки промени в рН е значителен. Промяната на рН води до промяна на степента на йонизация на молекулите в разтвора. По този начин се променя тяхната полярност, и като следствие се променят техните времена на задържане при HPLC разделяне.
По-големия проблем е, че промяната в рН на подвижната фаза променя времената на задържане на анализираните вещества от пробата в различна степен, и съответно влияе върху селективността на разделянето. Това може да означава, че пиковете се раздалечават един от друг, но също така означава, че при дадено рН те ще се коелуират, и реда на излизането им от колоната може да се промени.
Следователно при такъв тип разделяния е важно рН да се контролира чрез използване на буфер в подвижната фаза.
pKa
Едно от най-важните неща, които трябва да се знаят за буферите, е тяхната pKa стойност. pKa (дисоциационна константа или йонизационна константа) е мярка за силата на една киселина или база, и ни позволява да определим степента на йонизация при дадено рН.
Силни киселини и силни основи са тези съединения, които са напълно йонизирани в целия рН диапазон от 0 до 14, а слабите киселини и бази не са напълно йонизирани в този диапазон.
За киселините равновесната константа Ка, която изразява съотношението между тяхната йонизирана и неутрална форма, се изразява като:
Ka = { H+ } { A- } / { H }
pKa представлява отрицателен десетичен логаритъм от Ка:
pKa = -log10 ( Ka )
При дадена температура това са термодинамични йонизационни константи, които зависят от концентрацията. Тъй като log 1 = 0,
стойността на pKa отговаря на рН стойността, при която концентрацията на йонизираните форми е равна на концентрацията на неутралните форми.
Забележете, че pKa стойностите са зависими от температурата. Прието е стойността на pKa да се дава при 25°C.
Примера по-долу показва киселина с pKa стойност 8.0:
Примера по-долу показва базична молекула с pKa стойност 8.0:
Примера по-долу показва цвитерйон с pKa стойност на базичната част 5.6 и pKa на киселинната част 7.0:
Какъв буфер при какво рН да използваме?
pH буферите трябва да бъдат използвани в диапазона +/- 1 pH единици от неговата pKa стойност. Когато се използва този подход, буфера ще променя степента си на йонизация, за да противостои на всеки опит за промяна в рН.
Много HPLC методи са разработени с неподходящи буфери с рН, което е далече от техните pKa стойности. При тази ситуация, помощта, която ни оказва използването на буфера за поддържането на рН, е единствено поради факта, че неговата концентрация е много по-висока от тази на пробата.
Таблицата по-долу представлява списък от буфери с техните pKa стойности и pH диапазона, в който да се използват.
Процедура за избор на буфер
Задайте останалите условия на HPLC метода и направете анализ на тестови проби при различно рН на подвижната фаза, за да установите ефекта от промяната на рН. Изберете оптималната стойност на рН за даденото разделяне.
С помощта на таблицата изберете подходящите за вашия анализ буфери, чиито pKa стойности са в рамките на 1 pH единица от желаното pH на подвижната фаза.
Ако използвате УВ или флуоресцентен детектор, проверете границата на „УВ прозрачност“ на буфера, за да сте сигурни, че той няма да поглъща при дължината на вълната, която сте избрали за детектиране на анализираните съединения.
| Буфер | pKa | pH обхват | UV прозрачност (A > 0.5) |
| 1-methylpiperidine HCI/1-methylpiperidine | 10.1 | 9.1 - 11.1 | 215 nm (10 mM) |
| Ammonium acetate |
4.8 9.2 |
3.8 - 5.8 8.2 - 10.2 |
205 (10mM) |
| Ammonium formate |
3.8 9.2 |
2.8 - 4.8 8.2 - 10.2 |
|
| Ammonium hydroxide./ammonia | 9.2 | 8.2 - 10.2 | 200 nm (10mM) |
| Bis-tris propane HCI/Bis-tris propane | 6.8 | 5.8 - 7.8 | 215 nm (10mM) |
| Bis-tris propane HCI/Bis-tris propane | 9.0 | 8.0 - 10.0 | 225 nm (10mM) |
| Borate (H3BO3/Na2B4O7 10 H2O ) | 9.2 | 8.2 - 10.2 | |
| Diethylamine HCI/diethylamine | 10.5 | 9.5 - 11.5 | |
| Glycine HCI/glycine | 9.8 | 8.8 - 10.8 | |
| KH2PO4/ K2PO4/ | 7.2 | 6.2 - 8.2 | <200 nm (0.1%) |
| KH2PO4/phosphoric acid | 2.1 | 1.1 - 3.1 | <200 nm (0.1%) |
| Potassium acetate/acetic acid | 4.8 | 3.8 - 5.8 | 210 nm (10mM) |
| Potassium formate/formic acid | 3.8 | 2.8 - 4.8 | 210 nm (10 mM) |
| Pyrollidine HCI/pyrollidine | 11.3 | 10.3 - 12.3 | |
| Triethylamine HCI/triethylamine | 11.0 | 10.0 - 12.0 | <200 nm (10 mM) |
| Trifluoroacetic acid | < 2 | 1.5 - 2.5 | 210 nm (0.1%) |
| Tri-K-Citrate/hydrochloric acid 1 | 3.1 | 2.1 - 4.1 | 230 nm (10mM) |
| Tri-K-Citrate/hydrochloric acid 2 | 4.7 | 3.7 - 5.7 | 230 nm (10mM) |
| Tri-K-Citrate/hydrochloric acid 3 | 5.4 | 4.4 - 6.4 | 230 nm (10mM) |
| Tris HCI/Tris | 8.3 | 7.3 - 9.3 | 205 nm (10 mM) |
Концентрация на буфера
Концентрацията на буфера е важна поради три причини.
На първо място, селективността на разделянето се влияе от концентрацията на буфера. При нарастване на концентрацията полярните молекули се елуират по-бързо. Но за различните компоненти на пробата степента, с която намалява времето на задържане, може да бъде различна. От друга страна следва, че коелуиращите се пикове могат да бъдат разделени при различна концентрацията на буфера.
Ако концентрацията на буфера е много ниска, той няма да може да се държи като буфер. От това следва, че стойността на рН повече няма да може да бъде поддържана на необходимото ниво, и като следствие – резултатите могат да варират в различните дни. Основно се казва, че трябва да е поне 0.005M.
Ако концентрацията на буфера е прекалено голяма, разтвора на елуента става вискозен (от това налягането може да стане неприемливо високо), базирания на силикагел пълнеж на колоната ще започне да се разтваря дори под рН 7, а разтворимостта на буфера също става проблем, когато се смеси с органичния разтворител. По този начин приготвянето на елуента става по-трудно, а използването на градиенти става рисково занимание. Обикновено концентрация от 0.1М/L трябва да е максимума.
Ако се двоумите, използвайте концентрация на буфера между 20 и 50 mM/L. Ако селективността не е проблем на разделянето, такава концентрация би трябвало да работи добре. Ако пиковете се коелуират, опитайте малко да увеличите концентрацията, но не повече от 0.1M/L.
Източник: LaserChrom UK
