Избирането на правилна колона е важно решение, но, поради огромното разнообразие от предлагани на пазара продукти, изборът не винаги е лесен. Целта този базисен справочник е да бъдат подчертани факторите, които трябва да бъдат взимани предвид, когато купувате колона и по какъв най-добър начин да бъде стеснен широкия кръг от възможности сред HPLC колоните на пазара.

Кратко въведение

Всяка HPLC колона е може би най-важната част от всека инструментална система, тъй като в нея се извършват разделянията. В много от случаите колоните са продукт на най-напредналите технологии в хроматографията, и в същото време всички те са усъвършенствани версии на стандартната колонна хроматография. Основната разлика е в това, че вместо да се придвижва по гравитачен път във вертикална колона, разтворителя бива пропускан с високо налягане през HPLC колоната , което прави разделенията много по-бързи и ефективни.

Използването на по-високо налягане позволява като неподвижна фаза да бъдат използвани материали с по-малък размер на частиците. Това играе много съществено значение, тъй като по този начин се осигурява по-голяма повърхност за взаимодействия между неподвижната фаза и молекулите в подвижната фаза, а така се увеличава ефективността на разделянето. В UHPLC – техниките (свръх-високоефективна течна хроматография) се използват дори още по-малки частици на пълнежа (<2 µm), което води до увеличена разделителна способност и чувствителност на системата за разделяне. UHPLC изисква постигането на доста по-високо налягане в сравнение с конвенционалните HPLC техники, което означава и нужда от относително по-скъпи UHPLC системи. Едно друго усложнение е, че методите, разработени на HPLC не винаги могат да се трансферират напълно на UHPLC и обратно.

Да обмислим нашето приложение

За да се избере правилната колона, първото нещо, което трябва да бъде взето предвид, е самото приложение. За да се спрем на колона, трябва преди всичко да направим няколко неща, първото от които е да научим молекулната маса на анализираното съединение. По принцип аналитите се делят на две основни групи: нискомолекулни (MW <2000 g/mol), и високомолекулни, с MW >2000 g/mol. Поставянето на нашия аналит или аналити в една от тези групи би трябвало да е относително лесно. Второ – трябва да научим дали аналита е разтворим във вода или в органични разтворители. Накрая може да бъде определен и режима на хроматографиране, за да се стесни избора от колони.

Един такъв процес е представен схематично на Фиг. 1 и работи по следния начин: ако нашето анализирано съединение е < 2000 g/mol, тогава започваме избора си от горната клетка, и ако съединението е водоразтворимо, трябва да се преместим към клетка водоразтворими. Ако няма йонен характер, тогава хроматографския режим за разделянето ще бъде обратна фаза.

Фиг. 1 – определяне режима на разделяне

И HPLC, и UHPLC техниките се използват рутинно за аналитични изследвания, от чисто научни хроматографски експерименти, до експерименти по откриването на нови лекарства. Когато хроматографиите биват прилагана например при изпитването на нови лекарствени молекули, те доказано повишават вероятността за успех на целия процес по създаване на лекарственото средство. С помощта на хроматографските техники от процесите по създаването на лекарство още в началото могат да бъдат отстранени неподходящи молекули, чрез проучване на метаболитната стабилност и получаването на токсични метаболити. HPLC и UHPLC се прилагат изключително успешно също при и анализи на сложни проби, като почви, води в околната среда или пък експлозиви, каквито се извършват в при контрола и опазването на околната среда и съответно – в криминалистиката. Полезните приложения на HPLC и UHPLC могат да бъдат значително подобрени и разширени чрез свързването им с масспектрометри.

Избор на колона: Неподвижната фаза

Избора на най-добрата колона за нашето приложение трябва да бъде базиран на четири основни условия. Първото и най-важно от тях е типа на подвижната фаза. Обикновено колоните са пълни с порьозни частици, покрити с материал, който взаимодейства с молекулите в инжектираната проба. В истинския смисъл на думата "неподвижна фаза" HPLC използва различни химични функционалности, които са прикрепени здраво за частиците на пълнежа, и не се отделят по време на използването на колоната. Има много начини да се категоризират типовете неподвижна фаза, които се предлагат на пазара, но една от най-разпространените категоризации е така наречената "L" система на USP (United States Pharmacopeia". Представлява списък с над 60 класа колони, подредени според типа на свързаната неподвижна фаза (C18, C8 …), материала на частиците на пълнежа и техния размер. Фиг. 2 показва някои от най-често използваните видове колони.

Фиг. 2 – Често използвани типове колони по USP

Съществуват две техники за разделяне, използвани обикновено в HPLC – нормалнофазова и обратнофазова, като и двете зависят от относителната полярност на използвания за подвижна фаза разтворител, от една страна, и неподвижната фаза – от друга. Обратнофазовата HPLC е най-често използвания тип хроматографска техника.

Нормалнофазова (НФ) високоефективна течна хроматография (HPLC)

В НФ HPLC използваните разтворители са неполярни, така, че полярните съединения в смес, която се пропуска през колоната, ще бъдат задържани от полярната неподвижна фаза на пълнежа. По-бързо се елуират по-неполярните съединения.

Обратнофазова (ОФ) HPLC

При ОФ HPLC повърхността на пълнежа се модифицира с дълги въглеводородни вериги, за да и бъде придаден неполярен характер. Обикновено тези вериги са на хидрофобни алифатни въглеводороди с 4, 8 или 18 въглеродни атома дължина (производителите могат да наименуват своите колони в зависимост от броя на въглеродните атоми, напр. C4, C8, C18). От изброените вериги C4 се използва обикновено за разделяне на протеини, а C8 и C18 - за малки молекули и пептиди. Прибавянето на тези алкилни вериги означава, че полярните молекули в сместа ще пребивават повече време, придвижвайки се в подвижната фаза. Неполярните съединения ще се прикрепят към въглеводородните групи и следователно ще пребивават по-малко време в подвижната фаза, като по този начин се забавят при преминаването си през колоната. Така, че за разлика от НФ HPLC, тук полярните молекули ще преминават по-бързо през колоната.

Избор на колона: размер на частиците

Следващия параметър, на който трябва да обърнем внимание, е размера на частиците, от които е съставен пълнежа на колоната. Ако всички други характеристики са едни и същи, колкото по-малки са частиците, толкова е по-ефективно е разделянето. Основния проблем с намаляването на размера на частиците. от 10, през 7 и 5 до 3микрона в диаметър е, че налягането, което генерира колоната, расте експоненциално. Колона с 3-микронови частици е приблизително два пъти по-ефективна в сравнение със същата колона, но пълна с 5-микронови частици, но създаваното от нея налягане е близо три пъти по-високо от това при 5-микронова колона. Въпреки, че ефективността на разделяне може да бъде увеличена чрез използване на дори още по-малки частици на пълнежа, под 2 микрона, апаратурата за такива анализи е значително по-скъпа, тъй като трябва да може да поддържа и да работи при екстремно високи налягания. Такива системи биват наричани основно UHPLC (Ultra-HPLC), а също и UPLC, RSLC, RRLC. С колоните за UHPLC могат да бъдат скъсени времената за анализ, както и да бъдат постигнати по-чисти разделяния, по-тесни и по-високи пикове, а също така обикновено биват достигнати и значително по-ниски граници на откриваемост (детектиране)

Избор на колона: порьозност и капацитет на задържане

Капацитета на задържане (или най-просто казано времето, което пробите прекарват в колоната) е важен както за качеството, така и за скоростта на разделянето. Колона, на която аналитите се елуират в дълъг период от време, няма да ни свърши работа при високопроизводителни приложения. Капацитета на задържане зависи от специфичната повърхностна площ на пълнежа и количеството свързан към повърхността на пълнежа въглерод (при ОФ колони със свързана фаза). Размера на порите на пълнежа е важен за определяне на капацитета на задържане, тъй като специфичната повърхностна площ е обратнопропорционална на размера на порите. В колона с по-големи пори на частиците аналитете се задържат по-малко време при еднакви други условия. Размера на порите на частиците обикновено се измерва в ангстрьоми (1 Å = 0.1 nm) и обикновено варира между 100 и 1000 Å. 300 Å е най-популярния размера на порите при анализ на протеини и пептиди, а колони със 100Å големина на порите се използват най-често за анализ на малки молекули.

Избор на колона: размери на колоната

Последното нещо, на което трябва да обърнем внимание, са размерите на самата колона. По-широките колони са приложими в процесите на скалиране, които се извършват при препаративни и полупрепаративни разделяния, а по-тесните колони в общи линии предлагат по-висока чувствителност на анализа и работа с по-малки количества проба – затова те се използват при аналитичните приложения на HPLC и UHPLC.

Необходимата дължина на колоната се определя от броя на съединенията, които трябва да бъдат разделени, и техния тип. Дългите колони предлат по-висока разделителна спосoбност/чувствителност, но използването им е свързано с по-дълго време на анализа и подържането на по-високо налягане. На-добрия вариант е да се избере възможно най-късата колона за нашето приложение, която предлага необходимата ни разделителна способност на хроматографската система.

Вътрешния диаметър (Internal diameter - ID) на една HPLC колона влияе върху чувствителността на анализа върху разделителната способност. Колоните с по-малък ID биха увеличили чувствителността на анализа, и използването им  се свързва с намаляването на обемната скорост на подвижната фаза (за да бъде запазена постоянна линейната скорост), което от своя страна води до увеличаване времето за анализ. Най-често използвани в практиката са HPLC колони с вътрешен диаметър 4.6mm. Вътрешния диаметър също влияе и върху капацитета на колоната по отношение на количеството проба, което може да бъде нанесено (инжектирано) върху колоната, без да се влоши качеството на разделянето. По-широките колони се използват предимно в индустриални приложения, където се работи със значително по-големи количества проби в сравнение с аналитичните приложения, при които използването на по-тесни колони води до увеличаване чувствителността на анализите и, отново във връзка с размера, до по-нисък разход на разтворители за подвижната фаза.

Като заключение можем да обобщим:

• Колоните с по-голям ID (над 10 mm) се използват главно за пречистване на големи количества материал, поради по-големия им капацитет по отношение на количеството нанесена върху колоната проба
• Аналитичните HPLC колони (напр. ID = 4.6 mm) са най-често използвания тип хроматографски колони. Те се прилагат най-често за качествен и количествен анализ на най-разнообразни видове проби.
• Тесни колони (Narrow-bore) с вътрешен диаметър 1–2 mm се използват за приложения, където се изсква по-висока чувствителност.
• Капилярните колони (ID ≤ 0.3 mm) се използват почти изключително в комбинация с масспектрометри като детектори на елуиращите се от колоната съединения, напр. пептиди и други биомолекули.

Поглед в бъдещето

Сред най-последните разработки в областта на високоефективната течна хроматография е използването на колони с порьозно-слоест строеж на частиците на пълнежа. Производителите декларират, че те осигуряват "UHPLC ефективност" на колоните, еквивалентна на тази при <2-микроновите колони, но при налягане, което може да бъде достигнато от конвенционалните HPLC-системи. При тази технология се произвеждат частици на пълнежа, които са съставени от плътно силикагелно ядро и свързан към него порьозен слой от силикагел, като към последния вече биват свързани различни функционални групи (свързана фаза). Голямото предимство при използването на порьозно-слоести колони пред UHPLC е факта, че докато методите, разработени на UHPLC, не могат да бъдат трансферирани към конвенционална HPLC и обратно, без двете лаборатории да имат идентични апарати, с порьозно-слоестите колони различните лаборатории трябва само да си осигурят същия вид колона.

Заключение

На пазара се предлагат много различни типове колони и намирането на подходящата за нашето приложение може да изглежда трудно, но чрез прилагането на няколко прости съображения, избора на правилната колона става сравнително лесна задача. Веднъж, след като на база типа анализирани вещества определим режима на разделяне, остават само 4 фактора, на които трябва да обърнем внимание, за да си помогнем при избора на подходяща колона и да оптимизираме нашето разделяне.

Надяваме се, че тази базисна информация за факторите, които е необходимо да вземем предвид при избор на подходяща колона, ви беше полезна, и ако е така, може да решите да я споделите. При всички случай ще се радваме да получим вашата оценка, за да направим блога по достъпен и съдържателен.

Използван източник: http://www.selectscience.net/separations