Детекторът по индекс на пречупване (RI)е уникален сред останалите широко използвани детектори за течна хроматография (ТХ), тъй като е наистина универсален със своите възможности за детектиране.
ТХ детектори,базирани на поглъщане на ултравиолетова светлина (УВ), са най-широко използваните поради редица причини: те са прости, надеждни, чувствителни и са приложими за голямо разнообразие от проби, но само ако съединенията имат достатъчно силна UV абсорбция. Флуоресцентните детектори са много по-селективни от УВдетекторите и могат да бъдат по-чувствителни, но детектират само съединения, които флуоресцират. Мас-спектрометричните (MS) детектори могат да бъдат изключително селективни и чувствителни, но само ако аналитите могат да се йонизират.RI детекторите отчитат основно и универсално свойство на веществата–техният индекс на пречупване. По-често представяни като диференциални детектори по индекс на пречупване, тези детектори отчитат пикове на база разликата между индекса на пречупване на изследваното съединение и индекса на пречупване на чистата подвижната фаза.Това е предимство, което прави рефрактометричните детектори универсални, е също и негов недостатък. Проблемът идва от това, че детекторът е чувствителен към всеки фактор, който повлиява индекса на пречупване. Такива фактори са температурата, налягането и състава на подвижната фаза.
В следващите редове ще се изложи как работят RI детекторите и някои добри практики, които трябва да се спазват, за да се извлече максимума от този мощен детектор.
Как работи RI детектора
Фиг. 1 - Figure 1: Основна схема на детектор по индекс на пречупване, показваща основните компоненти.
Нека първо разгледаме как работи един рефрактометричен детектор. Съществуват специфични конструкционни различия между детекторите на различните производители, но повечето основни елементи са схематизирани на Фиг. 1. Всички рефрактометрични детектори зависят от фундаменталното свойство на пречупване на светлината, или промяна на ъгъла на пречупване при преминаване на светлината през различни материали. При рефрактометричните детектори светлината преминава през прозрачните стени на проточната клетка и през флуида, който я изпълва. При всеки преход светлината се пречупва и променя минимално посоката си.Вместо да отчитат промяната в абсолютния индекс на пречупване (което могат да правят някои RI детектори), повечето детектори измерват диференциалното пречупване между проточната клетка на пробата и статичната сравнителна клетка, която е пълна с подвижна фаза. По този начин от сигнала на пробата се изважда фоновия сигнал (от подвижната фаза). Тъй като светлина с по-дълги дължини на вълните се пречупва повече, отколкото такава с по-къси дължини на вълните, при повечето RI детектори като източник на светлина се използват волфрамови лампи или светодиоди. При предлаганите на пазара RI детектори на различните производители се използват светлинни източници, генериращи светлина с дължини на вълните от 660 - 880 nm. След като светлината премине през клетката на пробата и на сравнителната клетка, тя трябва да се детектира. Най-често това става посредством двойка фотодиоди. При промяна на индекса на пречупване се променя и позицията на светлинния лъч върху фотодиодите – така, че върху всеки диод попада повече или по-малко светлина. Тази промяна на позицията може да се отчете, като се сравни относителната интензивност на сигнала, получен от двата фотодиода. На Фиг. 1 може да се види, че повечето от светлината попада на горния диод. При промяна на индекса на пречупване, светлинният лъч ще се придвижи надолу, осветявайки повече долния диод отколкото горния.
При предлаганите на пазара рефрактометрични детектори, към основните компоненти, показани на Фиг. 1, производителите добавят различни хардуерни подобрения, които стабилизират детектора и опростяват неговата работа. Сравнителната клетка трябва да бъде напълнена със същата подвижна фаза, каквато ще преминава и през проточната клетка по време на анализа (разбира се без аналита). За да се улесни този процес е добавен превключвателен клапан, чрез който може да се насочва подвижната фаза през сравнителната клетка. Тъй като за стабилизация на детектора могат да бъдат необходими до няколко часа, превключвателния клапан може да се настрои да връща подвижната фаза в първоначалния и резервоар, избягвайки по този начин загубата на подвижна фаза, докато детектора се стабилизира.
Промяната в температурата на околната среда може да бъде основен проблем при рефрактометричните детектори, тъй като индекса на пречупване на флуидите зависи от тяхната температура. Затова тези детектори са поставени в специални изолирани отделения, като при повечето комерсиални детектори температурата вътре може да се контролира. Повечето детектори могат да се термостатират при температури над тези на околната среда, обикновено от около 30-35ºС до 50-60ºС, но някои модели могат да поддържат по-ниска температура от тази на околната среда. Подвижната фаза трябва да постъпва в проточната клетка със същата температура, при която работи детектора, затова са добавени топлообменници, които да стабилизират нейната температура до точно зададена стойност. Обемът на топлообменниците трябва да е от 5 до 10 пъти по-голям от този на проточните клетки, чийто обем е сравнително малък (от порядъка на 8-10 µl). Този необходим допълнителен обем означава, че обикновено RI детекторите генерират по-широки пикове в сравнение с UV детекторите, които като цяло имат по-малък обем мъртъв обем.
Характерния дизайн на RI детекторите и техните основни принципи на работа ги правят податливи на проблеми от няколко основни вида. И по-конкретно – всичко, което причинява промени в температурата, налягането или води до промяна в състава на подвижната фаза, ще породи промени в индекса на пречупване на подвижната фаза, която преминава през клетката на пробата. Ако това не се компенсира от статичната подвижна фаза в сравнителната клетка, ще се появят отклонения на базовата линия. Нека сега разгледаме всеки един от тези проблеми поотделно.
Проблеми с температурата
Както беше описано по-горе, RI детекторите са конструирани по такъв начин, че проточната клетка да бъде предпазена от промени в температурата, едновременно чрез използването на . термоизолирано пространство за проточната клетка и топлообменник за постъпващата подвижна фаза. Въпреки това тези две решения са компромисен вариант между ефективност и цена. Проточната клетка не може да бъде напълно изолирана и предпазена от всички температурни промени, които се случват в заобикалящата я среда, затова може да се наложи да се вземат допълнителни мерки, за да се предпази апарата от локалните температурни флуктуации. Според индикатора на лабораторния климатик температурния контрол на лабораторията може да е добър, но въпреки това температурата може да варира. Това може да се дължи на директното обдухване на апарата от студен или топъл въздух, идващ от вентилацията на лаборарторията, или пък ако апарата е изложен на пряка слънчева светлина. Друг фактор може да е практиката в някои лаборатории да се подържа различна температура през деня и нощта. За да се избегнат тези проблеми, в някои лаборатории се изгражда специален бокс, предпазващ течния хроматограф. Ако все пак имате някои от тези проблеми, можете да пренасочите вентилационните вентили в друга посока или да преместите апарата на място с по-добър температурен контрол.
Работата на топлообменниците в детектора е да уеднаквяват температурата на постъпващата подвижна фаза с тази на флуида, намиращ се в проточната клетка. Поради факта че топлообменника увеличава мъртвия обем на системата, това решение представлява компромис между ефективността на температурния контрол и поддържането на малък мъртъв обем.За да се минимизира необходимостта от настройване на температурата, се препоръчва колонния термостат и детектора да са настроени на една и съща работна температура. Може също да се изолира и капилярата, свързваща колоната с детектора. Някои апарати идват с изолирана капилярна връзка, но може да се направи и самоделна изолация от гумена или полимерна тръбичка, която да се „облече” върху свързващата капиляра.
Стабилизрането и темперирането на детектора може да отнеме няколко часа, така че повечето детектори са снабдени с превключвателен клапан, с който се избягва загубата на подвижна фаза – чрез клапана подвижната фаза се връща обратно в изходните съдове и така апарата може да се остави да работи с включен поток за няколко часа. Когато апарата е стабилизиран и започваме анализ на проби, клапанът се завърта и подвижната фаза се насочва към отпадъка. Ако се използвате рециклиране на подвижната фаза, не забравяйте да я подменяте от време на време. За подвижни фази, съдържащи повече от 70% буфер (вода), препоръчвам да се подменят веднъж седмично. За подвижни фази, съдържащи 30% и повече органичен разтворител, периода на използване е по-дълъг – до няколко седмици. Подвижни фази, които се използват прекалено дълго, могат прогресивно да променят състава си. По-летливите компоненти могат да се изпарят, а също така е възможно развитието на бактерии, които запушват входящите фрити на хроматографската система. При смяна на подвижната фаза е много важно да се смени и съда, в който е поставена, за да се избегне пренасянето на всякакви замърсявания от старата фаза.
Проблемите, свързани с температурата, обикновено се проявяват като отклонения на базовата линия. В зависимост от големината на температурната промяна и чувствителността, на която е настроен детектора, отклонението на базовата линия може да е постепенно или стъпкообразно. Когато това отклонение създава проблеми, прегледайте изброените по-горе превантивни стъпки и вижте дали има нещо, което може да промените, за да редуцирате възникналия проблем.
Проблеми, свързани с налягането
Вторият фактор, който влияе върху индекса на пречупване, е налягането. За да се наблюдава минимално изменение на базовата линия, налягането в проточната клетка трябва да е постоянно. Повечето проточни клетки в RI детекторите могат да работят при максимално налягане от 100 psi (7 bar), като е честа практика да се използва ограничител на обратното налягане след клетката (back-pressure restrictor). Този ограничител представлява нещо като клапан, който през цялото време подържа фиксирано обратно налягане от порядъка на 75 psi (5 bar). Използването му осигурява работата на рефрактометричния детектор при постоянно налягане, като същевременно предпазва проточната клетка от превишаване на максимално допустимото налягане. Капилярна връзка с определена дължина, поставена след проточната клетка, също може да играе ролята на ограничител за обратно налягане. Това обаче е изпълнимо за случаите, в които потока на подвижната фаза не е прекалено висок. В противен случай, тъй като налягането се повишава с увеличаването на потока, това може да доведе до надвишаване на максималното работно налягане на проточната клетка.
Тъй като течнохроматографските системи работят при постоянен поток, налягането би трябвало да бъде постоянно. Обикновено е така, но проблеми с помпата могат да предизвикат промени в налягането,които могат да бъдат достатъчни, за да предизвикат отклонения в базовата линия, дори когато не се наблюдават други отклонения, като например промяна във времената на задържане. Неизправностите в помпата, които водят до непостоянно налягане, често пъти се проявяват като циклично изменение на базовата линия на рефрактометричните детектори. За да потвърдите едно такова предположение, е нужно да промените потока на подвижната фаза – по този начин цикличността в промяната на базовата линия също ще се промени в съответствие с тези нови условия. Например промяната на потока от 1ml/min на 2ml/min ще увеличи двойно честотата на цикъла на базовата линия. Често срещани източници на флуктуации в налягането са повреди на входящите и/или изходящите клапани на помпата, пропускащи уплътнения на буталата на помпата, мехурче в помпата и по-рядко счупено бутало на помпата. Най-лесно се проверяват наличието на мехурче в помпата и неефективното дегазиране. Проверете дали дегазера работи нормално, след което промийте помпата с висок поток за премахване на всякакви мехурчета в системата. Промивката на клапаните с метанол в ултразвукова вана за няколко минути в повечето случаи е достатъчно за почистването на замърсяванията и отблокирането им, освен ако клапаните не трябва да се подменят. Подмяната на уплътненията на помпата е малко по-сложно за изпълнение, но в повечето случаи може да се направи, като се следва сервизното упътване на помпата.
Проблеми, свързани с подвижната фаза
Всяка промяна на химичния състав на подвижната фаза ще повлияе както на нейният индекс на пречупване, така и на количеството разтворен въздух в самата подвижна фаза. Затова при работа с RI детектори се използва само изократен режим на елуиране, като подвижната фаза трябва да бъде старателно дегазирана. Повечето от модерните течнохроматографски системи притежават вградени дегазери (уверете се, че са включени правилно към вашата система), а в противен случай е препоръчително да се обезвъздуши фазата, като се продуха с хелий. Заради високата чувствителност на RI детекторите към съвсем минимални промени в индекса на пречупване, смесването на две или повече фази от самият апарат обикновено би породило проблеми. Съставките на подвижната фаза трябва да се смесят предварително на ръка, за да се избегнат каквито и да било промени в състава по време на работа на системата. Освен това в най-добрия случай като разтворител на пробите трябва да се използва подвижната фаза, което ще намали промяната на индекса на пречупване при мъртвото време на задържане на колоната (t0).
Запомнете, че RI детекторите измерват разликата в индекса на пречупване между съдържанието на сравнителната клетка и проточната клетка, и затова сравнителната клетка трябва да се промива с прясна подвижна фаза при всяка промяна в състава или при приготвяне на нова порция подвижна фаза. Добра идея е сравнителната клетка да се промива с подвижна фаза всеки ден, за да сме сигурни, че подвижната фаза, която използваме за анализа, и тази в сравнителната клетка, са напълно едни и същи. Когато променяме подвижната фаза с друга или промиваме с подвижна фаза нова хроматографска колона, достигането на равновесие в системата ще отнема по-дълго време в сравнение със същия случай, но при използване на UV детектор. При UV детектора и при почти всички останали детектори, за еквилибрирането на колоната през нея е достатъчно да премине подвижна фаза с обем около 10 пъти обема на колоната (около 15 ml за колона с размери 150mm x 4.6mm). За RI детектора е нужно значително повече време. Наблюдавайте базовата линия при смяна на разтворителя – в такъв случай отклонението й е обичайно, така че стабилната базова линия може да бъде добър индикатор за еквилибриране на колоната при система, ползваща RI детектор. Както споменахме по-горе, бъдете сигурни, че подвижната фаза се сменя редовно (особено при използването на подвижни фази с високо съдържание на вода), за да се предотврати появата на микроорганизми.
Допълнителни препоръки
Понякога RI детекторите се използват за различни приложения както с водни фази, така и с органични разтворители. Когато случаят е такъв, трябва да промиете изцяло системата (резервоари, дегазер, помпа, детектор и т.н.) последователно в серия с взаимно смесващи се разтворители. Например, преминете от водни разтворители към 100% ацетонитрил или метанол, след това към други органични разтворители. Ако не сте сигурни за предисторията на системата, заменете хроматографската колоната с капилярна тръбичка и промийте изцяло системата с 20-30 ml изопропанол. Изопропанола се смесва както с водни, така и с органични разтворители. След това пропуснете желаната подвижна фаза.
Шумът на базовата линия може да бъде един от критичните фактори за RI детекторите. Заради малката чувствителност на този детектор в сравнение с UV детектора, отношението сигнал-шум може да бъде лимитиращ фактор. Поради тази причина, може да поискате да се използвате по-голяма времева константа на детектора (филтър на шума) при работа с RI детектор. Добрата препоръка тук е да настроите константата на 10% от широчината на пика при базовата линия или на 20% от широчината на пика при неговата полувисочина. Например, при ширина на пик от 10 секунди може да използвате 1 секунда времева константа. По-голяма стойност на времевата константа би „изгладила” базовата линия, но прекалено голяма стойност ще „изглади” върховете на пиковете, правейки ги да изглеждат по-широки и по-ниски.
Ако дълго време не може да се установи от какво е породен проблема с шума на базовата линия, се препоръчва да се изключат един по един факторите, които са свързани с него. Например, може да изключите помпата или да направите потока нула, като по този начин изключите влиянието на помпата и на подвижната фаза. Ако проблема все се отчита, то той със сигурност е свързан с температурата.
Поради много високата чувствителност на RI детекторите към температурата, при работа с тях ключова дума е „търпение”. За всяка една промяна е необходимо време за уравновесяване на подвижната фаза, за подгряване на детектора и т.н. Ако времето за анализ е определящ фактор, е препоръчително да се остави детектора включен в режим на рециклиране на подвижната фаза. Друга вариант е да се намали скоростта на потока до минимум и да се остави цялата система в режим на готовност, което в последствие ще ни даде възможност много бързо да въведем системата в работен режим.
Ако търсите алтернативи на RI детекторите за универсално детектиране, може да използвате ELSD или CAD детектори. Тези два вида детектори се базират на изпаряване на подвижната фаза и детектиране на останалия „прах“ след това. Предимството при тях е, че могат да работят в градиентен режим, което е допълнително предимство, но са напълно ограничени за работа само с летливи подвижни фази – никакви фосфатни буфери не са позволени.
За всякакви други проблеми възникнали по време на работа е необходимо да се прочете внимателно сервизното упътване или да се потърси съвет в интернет пространството в специлизираните форуми за хроматография: www.chromforum.org 
или www.linkedin.com .
