Прехвърляне на градиентни методи чрез инструмента ACE LC Translator

Въведение

Прехвърлянето на градиентни методи в течната хроматография от една колона към друга е често срещана процедура, при която може да се окаже трудно постижимо запазването на селективността при разделянето и резолюцията на пиковете. За да бъде успешно подобно прехвърляне, е необходимо да се вземат предвид основните хроматографски принципи и внимателно да се оцени тяхното влияние. Пропускане на ключови параметри при изчисленията може да доведе до сериозни разлики в селективността или разделителната способност на пренесения градиентен метод. Инструментът ACE LC Translator е лесен за използване калкулатор, който е съобразен с основните хроматографски принципи, включващ всички ключови параметри и изчисления необходими за точното пренасяне на градиентни методи.

Преди да продължите е добре да свалите и отворите на вашия компютър ACE LC Translator

Опростено прехвърляне

Прехвърлянето означава пренасяне на даден хроматографски метод от един размер колона към друг. В същото време методът може да се прехвърли и на друга хроматографска система. С навлизането на все повече пълнежи (неподвижни фази) с частици под 2 микрона, много стари методи се прехвърлят от големи колони (например 150 х 4.6 mm) към по-малки (например 50 x 3.0 mm). Това е обусловено от стремежа да се оптимизират разходите и ефективността на дадена методика. Едновременно с това понякога възниква и обратната възможност - необходимостта метод  разработен от  R&D отдела на UHPLC системи, които са много бързи,  да се прехвърли на HPLC система за рутинна работа в производство или лаборатория за качествен контрол.

Основната цел при прехвърлянето на метода е да се запази селективността и резултатите на оригиналния метод. Точното пренасяне изисква да бъдат преизчислени потока, инжектирания обем и градиентите съобразно формата на новата колона. Освен това, обикновено е полезно да се направят корекции в пренесения метод, за да се съобрази с мъртвия обем на новата колона и хроматографска система. Инструментът  ACE LC Translator е разработен за успешно пренасяне на методики, като автоматично прави необходимите изчисления на базата на въведените данни за оригиналния метод и параметрите на хроматографската системата.

Пример: Прехвърляне на метод от HPLC към UHPLC

Фигура 1 показва HPLC разделяне на фармацевтичен API и сродни вещества на колона ACE Excel 5 C18-PFP, 150 x 4.6 mm ID, 5µm. В този пример методът е пренесен на UHPLC колона 50 x 3.0 mm ID, 1.7 µm.

Фигура 1: Разделяне на ацетаминофен и неговите сродни вещества на колона ACE Excel 5 C18-PFP, 150 x 4.6 mm ( поток 1 mL/min, инжектиран обем 5 µL). За пълното описание на метода виж приложение ACE AN4750.

Пръва стъпка: Информация за колоната

Първият етап при пренасянето е въвеждане на данните за колоната, която е използвана при оригиналния метод и тази, към която искаме да преминем (Фигура 2). Инструментът  ACE LC Translator използва тази информация, за да пресметне стойността за L/d_P (дължина на колоната / размер на частиците), която е показател за ефективността на колоната. Забележете, че е необходимо да се премине към колона с близка ефективност, за да се запази резолюцията и разделянето.

Порьозността на колоната също може да се въведе, за да се пресметне обема на колоната V_M. Правилните стойности са съответно 0.63 за напълнопорьозни колони ACE и 0.55 за колони ACE UltraCore. При други производители тези стойности може да са различни, но ако не са известни V_M може лесно да се определи експериментално от хроматографиста и да се въведе директно. За целта вижте таб Column Purosity в ACE LC Translator. Обемът на колоната се изполва, за да се определи правилно обемът на инжекцията и градиентния профил.

Фигура 2: Скрийншот на секцията с информация за колоната. Отляво са данните за оригиналната колона, а отдясно данните за новата колона, която ще се използва в пренесения метод.

Втора стъпка: Данни за оригиналния метод

При следващия етап се въвеждат данните от оригиналния метод (Фигура 3). За градиентни методи е добре да се направи точно експериментално определяне на вътрешния обем на LC системата. За настоящия пример оригиналният метод се провежда на бинарна HPLC система с вътрешен обем от 1.098 ml. Предвидена е и клетка, където се въвежда обратното налягане на инструмента, записано при метода. Макар и този показател да не е определящ, ACE LC Translator може да използва тази стойност, за да определи какво налягане се очаква при новия метод. Накрая се въвежда градиентния профил за оригиналния метод, включително и времето необходимо за уравновесяване на колоната в края на градиетната програма. Инструментът ще пресметне и очакваното подобряване на ефективността при новия метод след пренасянето.

Трета стъпка: Генериране на новия метод

След въвеждане на всички данни ACE LC Translator автоматично генерира новия градиентен метод (Фигура 3). Първо обемът на ижектиране се определя съобразно новия формат на колоната. Предлагат се две опции за величината на потока на пренесения метод. Той може да бъде такъв, че да се запази линейната скорост на мобилната фаза при новия вътрешен диаметър на колоната. Когато обаче се използва пълнеж с по-малък размер на частиците, потокът в пренесения метод може да се съобрази и с факта, че те постигат максималната си ефективност при по-висока скорост на мобилната фаза. Инструментът дава възможност ръчно да се въведе желаната скорост на потока за новия метод. При практическите изпитания е добре да се опитат няколко различни стойности в рамките между двете изчислени крайности, за да е сигурно, че обратното налягане и представянето на новия метод са подходящи.

Накрая е необходим вътрешният обем на LC системата за новия метод, която в разглеждания пример е кватернерна UHPLC помпа с обем 0.926 ml. След като цялата необходима инфорация е въведена инструментът ACE LC Translator генерира правилно пренесен градиентен метод. Важно е всеки сегмент на градиента да се пренесе точно и  да отговаря на съответните стойности за обема на колоната и мобилната фаза спрямо оригиналния метод, за да се запази селективността.

Уравнение 1: t_G означава времето на градиентния сегмент, F означава скоростта на потока, а V_M обема на колоната. Индексите 1 и 2 съответно означават стойностите при оригиналния и при пренесения метод.

Корекции за промяната на обема на системата и обема на колоната

При градиентните методи обема на системата и скоростта на потока определят колко време е необходимо на градиента, за да достигне до колоната. При пренасянето на метод вътрешният обем следва да е еднакъв за новият и за пренесения метод. Ако това не е така, ще възникнат големи разлики в селективността. ACE LC Translator преодолява този потенциален проблем, като изчислява необходимата корекция под формата на предвраително задържание или отложено инжектиране (Фигура 3) - достъпна опция в повечето използвани софтуеъри. Ако тази корекция не бъде направена при пренесения метод, селективността на разделянето може да се промени в сравнение с оригиналния метод и това да доведе до по-лоши резултати.

Фигура 3: Скрийншот на секцията с данни за градиентния метод в ACE LC Translator. Данните за оригиналния метод са въведени отляво, а новите данни за пренесения метод са автоматично изкарани отдясно.

Оригиналният метод и пренесеният UHPLC метод са показани съответно на фигура 4А и 4B. Както се вижда, инструментът ACE LC Translator успешно е генерирал градиентен метод, който е съхранил разделянето и резолюцията на оригиналния метод, като предлага значително по-добра ефективност. Ако пресметнатата корекция за компенсиране на разликата в обема на системата не се направи, оригиналното разделяне не се възпроизвежда точно – фигура 4С.

Фигура 4: А: Оригиналното HPLC разделяне с колона ACE Excel 5 C18-PFP. В: Пренесеният метод, който е пресметнат с ACE LC Translator и показва чудесни резултати след пренасянето на колона ACE Excel 1.7 C18-PFP, 50 x 3.0 mm с поток 1.25 mL/min. С: Пренесеният метод изпълнен без корекцията за компенсиране на разликата в обема на системата.

Заключение

В настоящата статия нагледно бе представено как с помощта на инструмента ACE LC Translator лесно и точно може да се пренесе даден градиентен метод от HPLC към UHPLC система. Чрез въвеждането на минимално количесво данни потребителят бързо може да генерира новия метод без нуждата от сложни изчисления. Качеството на пренесения метод е показано от получените експерименталните резултати представени на  фигура 4.