Как да определим извънколонната дисперсия и обем
Ширината на хроматографските пикове зависи от различни дисперсионни процеси, които действат както вътре, така и извън колоната. Извънколонният обем – ECV (extra column volume), е сериозен източник на извънколонна дисперсия – ECD (extra column dispersion). Заради него могат да се появят негативни последици, които да доведат до загуба на ефективност на колоната, а от там и до загуба на резолюция. В тази статия е засегната темата как лесно можем да определим и измерим показателите ECV и ECD.
Дисперсия
Когато ижектираме аналита в хроматографския апарат, той започва да се придвижва през системата и през колоната. Измерената в детектора ширина на вълната се влияе от дисперсионните процеси, които протичат в пълнежа на колоната (intra-column) и в компонентите на системата (extra-column). Общата наблюдавана дисперсия (σ2tot) определена като вариация на Гоусов пик, може да се изрази чрез формулата:
Където σ2col и σ2ext изразяват съответното участие на вътрешноколонната и извънколонната дисперсия (ECD).
Докато вътрешноколонната дисперсия е свързана със самата колона, ECD се влияе от два фактора, които хроматографиста може да оптимизира. Извънколонния обем (ECV) се съставлява от вътрешните обеми на различните компоненти на хроматографската система включително капилярни връзки, фитинги, аутосемплер и детектор. Той е основен източник на ECD. Ако ECV е голям може да се наблюдава значително разширяване на пиковете и загуба на ефикасност и резолюция. Факторите свързани с времето като скоростта на детектора също могат да окажат влияние върху ширината на пиковете. Важно е да се уверим, че настройките на детектора позволяват събиране на достатъчно информация за правилното определяне на пика. В тази статия ще насочим вниманието си към ECV и ECD, за да видим как те могат лесно да се определят за всяка LC система.
Влиянитето на ECV обикновено е пренебрежимо за по-големите хроматографски колони (например 150 х 4.6 mm ID). При по-малките обаче (например 50 х 2.1 mm ID) ефектите от ECV могат да са по-ясно изразени. Затова приложенията, които използват малки колони с пълнеж от малки частици, се нуждаят от хроматографска система с много оптимизиран ECV известна като UHPLC система. Възможно е също сериозно да се намали ECV на много от стандартните LC системи. Фигура 1 показва едно и също изократно разделяне с колона 75 х 3.0 mm ID на системи с малък и голям ECV. Дори и за тази средна по размер колона ефектът върху резолюцията е очевиден и би бил още по-изразен за по-малка колона.
Фигура 1: Сравнение на разделянето на аспирин и сродните вещества с колона ACE UltaCore 2.7 SuperC18 75 x 3.0 mm използвана на система с малък и голям ECV.
Ако има подозрения, че ECD може да е причина за лоши резултати при някоя аналитична методика, то би било добре да се потърсят възможности за намаляване на ECV или методът да се приложи на оптимизирана UHPLC система.
Възможно е също така методът да се трансферира към колона с по-голям размер, за да се ограничи ефектa от ECV. Както вече отбелязахме, скоростта при събирането на данни също трябва да се оптимизира, особено при много бързи разделяния или при използване на колони с малки размери. Недостатъчното събиране на данни може да е причина за лошо описване на хроматографските пикове, което води до изкуствено разширяване и загуба на ефективност.
Експерименталното опеределяне на ECV и ECD на системата е от изключително значение, за да сме сигурни, че изпозваната колона е с подходящи размери. Това може лесно да се направи като се изпълни следната процедура:
Подготвяме мобилна фаза: метанол / вода (49:51 v/v)
Проба: 1% ацетон в метанол / вода (49:51 v/v)
1. Заменяме колоната с конектор ZDV и настройваме температура 40°С.
2. Настройваме потока на 0.1 mL/min.
3. Настройваме UV детектора на 254 nm и режима за събиране на данни на максимална скорост.
4. След като се калибрира системата пускаме поне шест последователни инжекции по 0.5 µL. На фигура 2 е представена примерната хроматограма.
5. Записваме времето за задържане и ефективността при средата на височината, N0.5.
6. Извънколонният обем може да се пресметне по формулата:
Където tR е времето за задържане в минути а F е потока в µL/min.
7. ECD определяме по формулата:
8. Пресмятаме средноаритметичния резултат от шестте инжекции и тогава определяме RSD%. Той трябва да е под 2%.
*Някои хроматографски системи може да се нуждаят от ограничаващ клапан инсталиран след детекторната клетка, за да работят нормално при много малък поток и налягане.
Фигура 2: Примерна хроматограма постигната по експерименталния метод за определяне на ECV и ECD.
За улеснение можете да използвате и специалния инструмент включен в приложението ACE LC Translator, което е достъпно за сваляне и от страницата www.ace-hplc.com
Заключение
ECD може да има голямо негативно отражение върху резултатите на колоната, особено при разделяния с малки по обем колони. ECV е с основно влияние за ECD. Експерименталното определяне на двата показателя за всяка LC система позволява на хроматографиста да подбере подходящия размер колона, така че да постигне максимална ефективност.
