Как да определим мъртвия обем и порьозността на колоната

Измерването на вътрешния мъртъв обем на аналитичната колона за течна хроматография е полезно за различни приложения като: определяне на времето за постигане на равновесно състояние на колоната, настройка на обема на инжектиране, правилна настройка на градиентно елуиране и т.н.

Приблизително определяне на мъртвия обем

Приблизително пресмятане на обема на колоната в mL може да се направи чрез уравнението:

където L е дължината на колоната в mm, а d_c е вътрешния диаметър на колоната в mm.

С този метод може да се пресметне приблизителният обем с точност до 10%, което го прави подходящ, когато V_M не е от съществено значение, например за определяне на подходящите равновесни времена или достигане на равновесно положение на колоната след градиентен метод.

Изчисляване на V_M

За някои дейности, като трансфериране на метод, е необходимо по-точно определяне на вътрешния мъртъв обем на колоната. Изчисляването на обема на празната тръбичка от неръждаема стомана на една колона е лесно посредством формулата πr²L. Когато обаче колоната се напълни и пакетира с частиците на неподвижната фаза, само една малка част от този обем остава свободен и може да бъде зает от подвижната фаза. Когато умножим и по коефициянта на порьозност на частиците (ɛ) можем да направим точно пресмятане по формулата:

Трябва да се отбележи, че различните частици на неподвижните фази, например напълно порьозните и полупорьозните частици с твърдо ядро, имат различни коефициенти. Напълно порьозните частици на АСЕ имат коефициент 0.63 , докато частиците ACE UltraCore са с коефициент 0.55. Тези стойности варират при различните производители, което следва да се отчита в изчисленията. Таблици 1 и 2 показват изчислените стойности на V_M  за най-често използваните напълно- и полу- порьозни пълнежи на колоните ACE.

Таблица 1: Изчислени стойности за V_M в mL за често използвани напълно порьозни колони АСЕ 100 Å (ɛ=0.63)

Таблица 2: Изчислени стойности за V_M в mL за често използвани полупорьозни колони АСЕ UltraCore (ɛ=0.55)

Експериментално определяне на мъртвия обем на колоната и нейната порьозност

Ако не ни е известно колко порести са частиците на пълнежа или пък е необходимо да се направи много точно пресмятане, двете стойности V_M и ɛ, могат да се определят експериментално чрез измерване на мъртвото време на колоната (t₀) посредством инжектиране на аналит или разтворител, който няма задържане (виж фигура 1):

Фигура 1: Експериментално определяне на t₀ посредством инжекция с вода за колона ACE Excel 5 C18, 150 x 4.6 mm. Мобилна фаза MeCN:H₂O (40:60) + 0.1% мравчена киселина. Температура: 30⁰С. Детектор: UV, 210 nm.

Инжектирането на подобна проба или на чиста подвижна фаза (например вода) може да се използва за предизвикване на смущение в базовата линия в t₀ (фигура 1). Урацил или тиурея са често използвани за маркиране на t₀ при обратните фази, докато толуенът може да се използва за HILIC колоните. Йонните компоненти също могат да се използват за маркер, но е необходимо да се обърне специално внимание, за да се избегне обратно йонизиране от порите на пълнежните частици. Който и метод да се приложи, е важно да се измерва t₀ в една и съща точка на смущението на базовата линия при различните проби и колони. V_M може да се пресметне като умножим стойността на t₀ по скоростта на потока (F) измерена в mL/min:

Ако е необходимо може да се пресметне и порьозността на колоната по формулата:

Колони с малки размери

Когато замервате мъртвия обема на колоната посредством определяне на мъртвото време или t₀ , вие всъщност определяте обема на колоната заедно с извънколонния обем на системата ECV (extra column volume), който включва и потока в компонентите на аутосемплера, капилярните линии, детекторната клетка и др. Как се определя ECV ще бъде отделно разгледано в следваща статия #0017. За широкоизползваните колони с нормален диаметър (например 4.6mm i.d.) този обем е пренебрежимо малък спрямо обема на колоната. За по-малки колони обаче (например 2.1mm i.d.) този допълнителен обем може да окаже сериозно влияние и следва да бъде определен в mL и изваден следвайки формулата:

Заключение

Определянето на мъртвия може да се извършва по различна методика в зависимост от условията и целта, което го прави удобен и гъвкав инструмент за рутинна работа във всяка лаборатория.