Не всички C18 са еднакви

Когато за пръв път започнах да използвам LC, широко се смяташе, че всички C18 колони ще дадат еквивалентни разделяния. В действителност, Фармакопеята на САЩ (USP) в своята схема за класификация на колони класифицира колони С18 като "L1 - октадецилсилан, химически свързан с порест силициев диоксид или с керамични микрочастици, диаметър на частиците от 1,5 до 10 μm, или октадецилсилан химически свързан с монолитна пръчка от силициев диоксид" (3). През последните 40 години стана ясно, че не всички С18 са направени еднакво - много от тях ще направят коренно различни разделяния. В текущия списък, L-класификационната схема съдържа 74 различни типа колони (3), включително С18, С8, фенил, циано и много други. Дори колони, които имат един и същ етикет, като С18 или фенил, могат да имат значително различни селективни характеристики. Не е ясно колко различни колони с обратна фаза са налични, но по някои оценки има поне 1000 (4). При нашата работа в LC Resources, сме тествали повече от 500 различни колони с обратна фаза.

Фигура 1: Сравнение на симулирани хроматограми за С18 колони от три производителя. Размер на колоната: 150 mm × 4.6 mm, 5- μm частици; подвижна фаза: 50:50 ацетонитрил : 30 mM фосфатен буфер (рН 2.8); температура: 35 ° С; ефективност на колона N: 10,000. Задържане, нормализирано до връх 1. Вижте Таблица I за информация за колона и текст за подробности. Пикове: 1 = анизол, 2 = н-бутилбензоена киселина, 3 = толуен, 4 = мефенаминова киселина, 5 = етилбензен, 6 = транс-халкон.

Колко различни са C18 колоните една от друга? За да илюстрирам това, избрах набор от шест тестови съединения, които трябва да бъдат доста добре изразени (виж заглавието на фигура 1). Тоест при ниско рН (рН 2.8) те са неутрални или нейонизирани, така че йонните взаимодействия с колоната трябва да бъдат минимални. Аз произволно избрах три C18 колони от нашата база данни (5). Те са от добре известни източници, като всички колони са направени от силициев диоксид тип В (висока чистота). Това са симулирани сепарации на колони с размери 150 mm × 4,6 mm ID, 5 μm частици и генериращи 10 000 тарелки ефективност. За да опростим сравненията съм нормализирал задържането до първия пик (анизол). Първата колона (Фигура 1а) е нашата референтна колона. Можете да видите, че пикове 4 и 6 се припокриват, а разделителната способност е незначителна за пикове 2 и 3. Ако сложим C18 колоната на друг производител (Фигура 1b), разделянето на пикове 2 и 3 се подобрява и разделянето на последните три пиковете се променя, но не е по-добре от референтната колона. Колоната C18 на третия производител (фигура 1с) не е по-добра - тя показва добро разделяне за пикове 2 и 3, но пикове 4 и 6 все още се припокриват. На Фигура 1 може да се види как, въпреки че първите три пика са разделени от трите колони, селективността (относителното разстояние между пиковете) е различна за тези пикове. И нито една от трите колони не може да раздели последните три пика – още повече поредността на пиковете се променя! Така че не можете произволно да замените една C18 с друга и да очаквате същите резултати. Но от друга страна, различията не са достатъчни, за да можем чрез такава замяна да решим проблема с разделянето. Въпреки че има поне една колона С18 на даден производител, която ще раздели всичките шест съединения, промяната от една към друга в усилието да се получи желаното разделяне не е много добра стратегия.

Алтернативни неподвижни фази

 Друга техника, която се използва откакто се  занимавам с хроматография, е да се променя неподвижната фаза. Това означава, че потребителите преминават от С18 към фенил, циано или вградена полярна фаза. Можем да използваме същата проба и условия, за да видим какво ще се получи в този случай. Избрах колони от един и същи производител, и референтната колона от фигура 1а. Повтаряме същото хроматографското разделяне за референтната колона - фигура 2а (с леко удължено време)

Фигура 2: Сравнение на хроматограми за (а) С18, (b) фенил, и (c) колони  с вградена полярна група от същия производител. Други условия, както на фигура 1; вижте текста за подробности.

След това изпробваме фенилна неподвижна фаза на същият производител - фигура 2Ь. Очаквано разделянето на фенилната колона ще бъде много по-различно от С18, тъй като има ароматен характер, което води до разделяне на всички пикове, но не до базова линия. Бихме могли да коригираме подвижната фаза или да намалим размера на частиците (или и двете), за да получим разделяне до базова линия с тази колона. Фигура 2с показва разделянето на аналитите с колона на същия производител, но със фаза, в която е вградена полярна група (EPG). Тази колона осигурява добро разделяне на всички пикове - най-доброто досега. Забележете също, че пикове 2 и 3 са с разменени места. При този тест разликите между колоните са само за свързаната неподвижна фаза – имаме една и съща основа от силициев диоксид - силикагел. Тази техника за преминаване към различна стационарна фаза на един и същ производител е доста успешна през годините, но все не осигурява необходимата сигурност за задоволително разделяне.

Помощ чрез бази данни

 Друг начин да се избере колона, която е вероятно да има различна селективност, е да се използва базата данни за хроматографските колони на уебсайта на USP (5). Както е обяснено в предишни статии в LCGC (6,7) и другаде (например вж. Справка 8), в тази база данни може да намерите характеристики за повече от 500 обратна фазови колони. Тази информация може да се използва за подбор на подобни (еквивалентни) или различни (ортогонални) колони в сравнение с някаква референтна колона, като тази, която вече сте опитали. Като изберете опцията „Преглед на различни колони“, можете да видите кои колони са различни от референтната колона.

Фигура 3: Сравнение на разделянето получено при използване на (а) колона С18 от един производител с (b) колона от вградена полярна група от втори производител. Други условия, както на фигура 1; вижте текста за подробности.

Опитах това за настоящата проба, съдържаща някои киселини и неутрални съединения при ниско рН на подвижната фаза. Като моя референтна колона избрах същата колона С18, която използвахме на фигури 1а и 2а, и повторихме разделянето на фигура 3а (различна времева ос от другите фигури). Една от най-ортогоналните колони с частици от силициев диоксид тип В (използването на по-старите частици тип-А с ниска чистота не се препоръчва за нови разработки) е тази, използвана за получаване на разделянето, показано на Фигура ЗЬ. Това е колона EPG от различен производител спрямо референтната колона от фигура 3а. Възползвали сме се както от промяната на стационарната фаза, така и от промяната в източника на силикагел, което е допълнителен потенциал за селективността. Вижда се, че промяната е драстична(Фигура ЗЬ). Пик 5 се придвижва напред между пикове 1 и 2, а пик 6 се придвижва между пикове 2 и 3. Това определено е промяна в селективността. Няма гаранция, че препоръчаната колона ще раздели всички съединения във вашата проба, но има голяма вероятност разделянето да изглежда много по-различно, особено ако се възползвате от други променливи на селективността. В едно съвместно изследване (9) няколко фармацевтични лаборатории са тествали този подход върху типични проби, с които се сблъскват, и във всичките 11 от проверените случаи предсказаната ортогонална колона наистина дава значително по-различно разделяне.

Сравннение на колонната селективността

 Можем да направим визуални сравнения и да видим, че за настоящата проба, промяната от колоната на фигура 1а (същата като фигурите 2а и 3а) към колоната от фигура 2с или ЗЬ, би ни позволила да разделим всички аналити. Но кое от тези разделяния, ни носи най-голяма промяна?

Фигура 4: Графики на log k и log k за проба от Фигура 1. (а) Колона от Фигура 1а срещу 1b; (b) колона от Фигура За и Зb. Други условия, както на фигура 1; вижте текста за подробности.

Когато сравняване промените в селективността и се прави промяна в колона, е хубаво да имаме количествена мярка за тази промяна. Един от начините да се направи това, е да се направи графично сравнение на селективността. Това може да бъде постигнато чрез начертаване на задържането на една колона спрямо задържането на друга колона. Пример за това са колоните от фигура 1а и 1Ь, представено на фигура 4а. Разпръснатостта на точките в графиката е мярка за това колко различна е селективността между двете колони. Когато данните се групират плътно около линията и r² = 0.97 (Таблица I), се потвърждава този извод. Сравнете този резултат с този на фигура 4б. Сравнени са колоните от фигури 3а и 3б. Тук има много повече разсейване (r² = 0.49), което показва, че селективността е много различна между двете колони.

Реално пресмятане на промяната в селективността – α, е дори по-добър начин за сравнение на две колони. Приемаме, че k1 и k2 са факторите на задържане за два пика. Промяната в log α между двете колони е свързана с това, доколко данните са от линията на тренда в графиките на log k и log k, както е показано на фигура 4. Колкото по-голяма е средната промяна в log α, |δlog α|avg , между две колони, толкова по-голяма ще е и разликата в хроматограмата. Тази мярка за промяна в селективността, |δlog α|avg, е пряко свързана със стандартната грешка (SE) на графика, което е лесно да се пресметне с помощта на фигура 4.

Друга разработка е показала, че когато селективността се променя при разделяне с обратна фаза, било то чрез промяна на колона или друга променлива (например, тип разтворител или сила на разтворителя), стойността на |δlog α|avg ≥ 0.1 показва вероятността разделянето да е ортогонално (или значително различно) (9). За настоящите примери, направих тези изчисления за различните колони в сравнение с референтната колона (фигури 1а, 2а, 3а) и ги обобщих в таблица I. Може да се види, че колоната от фигура 2с почти достига желаната промяна, но колоната на фигура 3b има стойност на | δlog α | avg, която е повече от два пъти по-голяма от минималната препоръка. Това още веднъж потвърждава нашето визуално наблюдение върху разделянето.

USP база данни (5) дава още една мярка за разлики в селективността на колоните. Това е стойността на F_s, изчислена от характеристиките на колоната в базата данни (8). В едно проучване с 67 различни съединения, притежаващи различна структура, включващо киселини, основи и неутрални съединения, беше определено, че F_s> 65 ≈ | δlog α | avg ≥ 0.19 (9). Това означава, че базата данни може да се използва за търсене на колони с големи F_s-стойности в сравнение с текущата (референтната) колона, като по този начин ви дава увереност, че промените в пиковите интервали ще бъдат значителни. Аз представих табличните стойности на F_s в таблица I за шестте колони, които изследвахме, и избраната проба (неутрални и нейонизирани киселини). Можете да видите, че колоната на фигура 3б има F_s = 55, докато всички останали колони имат F_s ≤ 16. Това още веднъж потвърждава визуалните наблюдения, че това е най-ортогоналната колона на множеството.

Заключения

Видяхме, че промяната в химията на колоните може да бъде мощен инструмент за промяна на селективността при разделяне с обратнофаза хроматография. Промяната от C18 на един производител към такъв от друг производител обикновено има минимален резулт, както се вижда на Фигура 1. По-ефективен начин за да направите промяната, е да опитате с различна неподвижна фаза от използваната досега. Ако тази промяна е направена в рамките на една продуктова линия от колони, където се приема същият материал за поддържане на силикагел, промяната ще бъде резултат от промяна само на свързаната неподвижна фаза. Това е показано на фигура 2 за три различни свързани фази от една и съща продуктова линия на един производител. За да се получи още по-голям ефект в разделянето, може да се направи промяна в основния силициев диоксид (силикагел) заедно с промяна в свързаната фаза. Въпреки че това е възможно в рамките на продуктите на един производител, като например преминаването към различна фаза на свързване от различна продуктова линия от колони, такава промяна е по-вероятна, ако смените както производителя, така свързаната фаза (фигура 3).

Използването на друга колона за промяна на разделянето между пиковете идва с рискове за неподходящ подбор (Фигура 1 или Фигура 2b). Тези резултати също могат да бъдат скъпи, защото колоните са скъпи и времето за изследване е ценно. По-продуктивна техника е да се използват известни предварителни познания за разликите в селективността между конкретни колони, като тези, които са достъпни в базата данни на USP (5). Чрез използването на базата данни е лесно да се идентифицират колони, които най-вероятно имат различна селективност.

Когато се изследват промените в селективността, най-вероятно ще бъде по-практично да се изследва селективността от типа на разтворителя (1) или селективността от силата на разтворителя (2) преди селективността от типа колона, просто защото е по-евтино. Въпреки това, въоръжени с информацията, която сме обхванали в тази дискусия, можете да направите интелигентен избор за промяна на колоната, така че да увеличите възвръщаемостта на инвестицията от новата колона, за да промените селективността. Когато това се вземе под внимание, може да откриете, че скринингът на няколко колони с различна селективност е ползотворна инвестиция на време в началото на процеса.

Източници:

(1) J.W. Dolan, LCGC 28, 1022–1027 (2010).

(2) J.W. Dolan, LCGC 29, 28–34 (2011).

(3) United States Pharmacopeia, USP 34 NF 29, 982–983 (2011).

(4) R.E. Majors, personal communication.

(5) PQRI database at http://www.usp.org/USPNF/columns.html

(6) J.W. Dolan, LCGC 25, 1014–1020 (2007).

(7) L.R. Snyder, P.W. Carr, J.W. Dolan, and R.E. Majors, LCGC 28, 418–430 (2010).

(8) L.R. Snyder, J.W. Dolan, and P.W. Carr, Anal. Chem. 79, 3254–3262 (2007).

(9) J. Pellett, P. Lukulay, Y. Mao, W. Bowen, R. Reed, M. Ma, R.C. Munger, J.W. Dolan, L. Wrisley, K. Medwid, N.P. Toltl, C.C. Chan, M. Skibic, K. Biswas, K.A. Wells, and L.R. Snyder, J. Chromatogr. A 1101, 122–135 (2006).