Когато говорим за силен разтворител при обратно фазова хроматография, ние се отнасяме към органичния разтворител в подвижната фаза - ацетонитрил, метанол или тетрахидрофуран в повечето случаи - обикновено означен като В-разтворител или % В. По този начин по-силна мобилна фаза ще бъде с по-висок % В. Сега ще разгледаме промени в задържането, които се наблюдават с промяна в силата на разтворителя и как да се възползваме от тях, когато разработваме метод.

Фактор на задържане и мъртво време на колоната

В много случаи при разделянето с LC е по-полезно да се работи с фактора на задържане, k, отколкото с времето на задържане, t_R. Коефициентът на задържане се изчислява лесно като:

където t₀ е мъртвото време на колоната. Мъртвото време може да бъде измерено чрез инжектиране на незадържащо се вещество в обратна фаза и се наблюдава обратен пик на "фронта на разтворителя". Може да се оцени и мъртвият обемът на колоната, Vm, за 4.6 mm i.d. колони като:

където L е дължината на колоната в милиметри. Така за колона 100 mm × 4,6 mm обемът на колоната V m е ≈ 1 mL. Преобразувайте това в t₀ чрез разделяне на дебита. При 1 mL/min имаме t₀ ≈ 1 mL, при 2 mL/min ≈ 0.5 min. Ще използваме тази колона и скоростта на потока за следните примери.

Фактор на задържане и селективност

На Фигура 1 са показани симулирани хроматограми, базирани на данни за групата на нитроароматни съединенияИзползваната колона е с параметри 100 mm × 4,6 mm, 3-µm C18, работеща при скорост на потока 2 mL/min. Може  да се забележи t₀ маркировката при 0.5 min (стрелка). Всички знае, че времето на задържане намалява когато % B се увеличава. Наблюдават се съответно по-кратките времена на работа при увеличаване % B от 55% до 65% (Фигура 1). Една пренебрегвана промяна е, че селективността или разстоянието между пиковете често се променя с промяна  на % B. Например при 55% В, пикове 2 и 3 са с най-малко разделяне (Фигура 1). Това се наричао критична пикова двойка или, ако се интересуваме от резолюцията, като минимална резолюция. Трябва да се отбележи, че когато подвижната фаза се промененя на 60% В критичната пикова двойка се променя на пикове 4 и 5. Допълнителна промяна до 65% В допълнително съкращава цикъла и също променя критичния пиков чифт до пикове 3 и 4. Когато се променят хроматографски условия и наблюдаваме промяна в критичната пикова двойка, променената променлива е тази, която може да се използва за контролиране на разделянето. В настоящия пример,% В може да се използва за контролиране на разделянето. Това заслужава повече проучване.

Фигура 1: Симулирани хроматограми за смес от нитроароматни съединения при условия, изброени в текста. Стрелката показва t₀.

Фактор на задържане и сила на разтворителя

Забелязва се, че всеки пик на Фигура 1 се движи пропорционално когато %B (процент органика) се променя. Графично това може да се представи, ако изчислим „k“ за всеки пик и изведем функцията на log k срещу %B. На фигура 2 се наблюдва тази зависимост за пиковете от хроматограмите на  Фигура 1.

Фигура 2: Графика на log k спрямо% B за пикове 2-5 от Фигура 1.

Наблюдаваните графики са линейни и те могат да бъдат описани чрез уравнението:

където k₀ е k-стойността при 0% органика, а S е (отрицателният) наклон на графиката. Необходими са две експериментални стойности за изчисляване на k при всяка стойност на %В. По този начин, въз основа на две реални проби, можем да направин предвиждане за  задържане при всяка друга стойност %В, в границите на екстраполация от първоначалния набор от данни.

Въпреки че наклонът на различните аналити е приблизително еднакъв, има достатъчно разлика в S, така че пиковото разстояние се променя, когато %B се променя. В началото на фигура 2 пикове 2 и 3 са най-малко разстояние, което се наблюдава и при 55% В на фигура 1. По същия начин, в края на фигура 2 пикове 3 и 4 са най-малко разделени, което съответства на 65%В от фигура 1. Наклоните на пикове 4 и 5 са м​ного сходни, така че дори прималка промяна в пиковото разстояние се вижда при промяна в %B. Пик 3, от друга страна, има различен наклон от другите пикове и се движи спрямо пикове 2 и 4, когато %B се променя. Визуалната екстраполация ни позволява да предвидим, че пикове 2 и 3 ще бъдат коелуирани в подвижна фаза <55%В, докато пикове 3 и 4 ще бъдат коелуирани при някои мобилни фази с > 65%В.

Тези две наблюдавани поведения - линейност и промяна в относителното пиково разстояние с промяна в %B, са това, което прави силата на разтворителя толкова мощен инструмент за развитие на метода. Това означава, че можем да използваме малко количество експериментални данни, за да предвидим разделянето при различни условия.

Разделителна способност и сила на разтворителя

За да се възползваме напълно от силата на разтворителя, трябва да направим още две изчисления, за α и N:

където α е селективността или относителното пиково разстояние за съседна двойка пикове с k-стойности k₁ и k₂.

Втората формула е:

където N е брой теоритични тарелки (ефективност на колоната), а w е широчината на пика, измерена при базовата линия между допирателните към страните на пика.

Можем да комбинираме k, α и N, за да формираме това, което се нарича фундаментално уравнение на разделителната способност:

където Rs е разделителната способност между два съседни пика, а k обикновено се отнася до първия пик на интересуващата ни пикова двойка. От това уравнение следва, че комбинираме (i) ефективноста, (ii) селективниста и (iii) задържането на аналитите в хроматографската колона.

Сега имаме цялата информация за изчисляване на разделителната способност при различни съотношения на органиката (%B). Първо определяме поведението на всеки пик, като правим по две експериментални проби, за да  получим данните, необходими за изчисляване на k при %B, използвайки уравнение 3. Сега можем да определим коефициент (iii) в уравнение 6. Ако знаем k за всеки пик при различни %B , тогава може да се изчисли α с помощта на уравнение 4. Това ни дава информация за селективноста (ii) от уравнение 6. Всичко което ни трябва, за да намерим Rs, е или да се измери N, или приблизително да се определи. Колона от 150 mm колона, съдържаща 5-µm частици или 100 mm колона, пълна с 3-µm  частици, ще генерираt N ≈ 10,000 за реални проби. Това е удобно число, защото (10,000)^0.5 = 100, така че уравнение 6 се опростява до:

което може да се използва за оценка на разделителната способност за всяка двойка пикове при различен %B на базата на данни само от две експериментални проби.

Карта на разделителната способност

Въпреки че уравнение 6 или 7 ни позволява да изчислим разделителна способност за всяка двойка пикове при различни силни стойности на мобилната фаза, обикновено това не е разделителната способност на всички двойки пикове, които ни интересуват. , Ако изчислим разделителната способност между всяка двойка пикове за даден %B, можем да определим коя двойка пикове е критичната пикова двойка. Ако предричаме разделителната способност само на критичната пикова двойка срещу %B, получаваме карта на разделителната способност, както е показано в долната част на Фигура 3. Хроматограмите за пикове 2-5 на Фигура 1 са показани за няколко точки на картата на разделителната способност (интензитетите на пиковете се различават леко между фигури 1 и 3).

Фигура 3: Карта на разделителна способност за проба от фигура 1, показваща частични хроматограми за пикове 2, 3, 4 и 5. Критичната пикова двойка е обградена във всеки случай (пиковата интензивност се различава леко между фигури 1 и 3).

Няколко важни аспекта от картата за разделяне (фигура 3).

1. Условията за най-висока резолюция се идентифицират бързо: ≈56 %В. За да се намери този оптимален резултат, обаче ще са необходими повече от две или три проби. Например, първоначална проба от 90 %В би дал изключително кратки времена на задържане. Промяната до 70 %В би дала хроматограма с k ≈ 1 за първия пик и време на хроматографиране от около 2 минути. След тези резултати можем да започнем да прецизираме условията – намаление с 5% на органичния разтворител %В, докато не се доближим до желаният резултат (вероятно още 6-8 проби). Вместо това, бихме могли да използваме второто - 70 %В, движение като един от входовете и след това да намалим %B с 10-15% до 60% или 55% пробег. С тези три проби (една загубена и две полезни) имаме достатъчно данни, за да генерираме карта на раделителната способност. Намирането на условията за най-добра резолюция определено си струва тези два или три опита.

1. Вторият аспект на картата на резолюцията е, че ние можем бързо да идентифицираме условията, които трябва да се избягват - по-специално тези, при които се наблюдава пиково коелуиране. Припокриването на пикове се случва винаги, когато картата с разделителна способност спадне до нулева резолюция, например при ≈ 40%В, ≈ 50%В и ≈70%В. При всяко едно от тези условия една или повече двойки пикове се припокриват напълно. Например, в крайната част на хроматограмата в горната част на фигура 3, средните два пика се считат за критична пикова двойка (закръглена); когато %B се увеличава, пиковете ще се придвижат по-близо един до друг, докато те бъдат коелуирани при 70%В. Тогава тяхната разделителна способност ще се увеличи, тъй като те разменят реда си и се разделят.

1. Трето важно приложение на картата за разделителната способност е да се оцени устойчивостта на разделянето от променливата - %B в този случай. Можем да видим, че най-високата разделителна способност е ≈56% В, но тя намалява бързо с намаляване на %B. От друга страна, резолюцията намалява по-бавно, когато %B се увеличава. Относително плоската област на картата има между ≈56%В и ≈65%В, което ни кара да заключим, че ако използваме 60%В като концентрация в подвижна фаза по подразбиране, методът би могъл да понесе ≈ ± 2%B без значителна загуба на разделителна способност. Можем да използваме тази информация, за да идентифицираме ограниченията за тестване на устойчивостта.

Колко добри са прогнозите?

В известен смисъл картата с резолюцията изглежда твърде добра, за да е истина. Можете ли наистина да направим само две проби и да предскажем разделянето при всеки друг %B?

Е, да и не. Принципът "вкаран боклук - изкаран боклук" се съдържа и тук - ако събирате висококачествени входни данни, за да направите изчисленията, резултатите могат да бъдат доста добри. Прогнозите за k имат грешки <5% за интерполация между първоначалните пробези и разумна екстраполация извън входните стойности. Вероятно прогнозните стойности на разделителната способност са по-малко точни поради два фактора. Едно от тях е свързано с избора на броя теоритични тарелки, използван в изчисленията. Уравнение 7 приема N = 10,000 и очевидно е ограничено до тези условия. Уравнение 6 използва един и същ брой теоритични тарелки за всички пикове. Най-големият недостатък на уравнение 6 е, че той не взема впредвид асиметрията на пика. Повечето пикове достигат до някаква степен на асиметрия и тази опашка има тенденцията да намалява разделителната способност. Корекциите за опашката може да изчисли софтуерът за картографиране на търговската резолюция, като DryLab (Molnar Institut, Berlin, Германия). Той може да вземе впредвид пиковите данни и броя теоритични тарелки за всеки пик при генериране на карта за резолюция. Във всеки случай, картата на разделяне, генерирана от уравнения 6 или 7, ще идентифицира условията за най-голямо разделяне, дори ако прогнозираната стойност на разделителната способност не е точно това, което се наблюдава експериментално.

Заключения

"LC Troubleshooting " (1) разгледа използването на селективност от типа на разтворителя като средство за контрол на разстоянието между пиковете в хроматограмата. "LC Troubleshooting " (2) разгледа селективността на силата на разтворителя. Въпреки че промяната в силата на разтворителя обикновено показва малък  ефект върху селективността, отколкото промените в типа на разтворителя, селективността на разтворител-сила е достатъчно мощна, за да се постигнат задоволителни условия на разделян. Тъй като тази техника изисква само два или три експериментални изпитвания, тя е по-лесна и бърза от промяната от един разтворител към друг. Ако само корекциите на %B са недостатъчни, за да се получи желаното разделяне, то ние сме намерили условията за един от ъглите в подхода на триъгълника на селективност на разтворителя, "LC Troubleshooting " (1). Поради тези причини препоръчвам изследване на  силата на разтворителя преди типа на разтворителя по време на разработването на метода. Въпреки че можете да извършите всички изчисления на ръка, като използвате уравненията, дадени погоре, процесът ще бъде много по-бърз и по-малко разочароващ, ако използвате софтуер за моделиране на резолюция.

Препратки:

(1) J.W. Dolan, LCGC Северна Америка 28 (12), 1022–1027 (2010).