Повърхностно порести частици (SPPs)  и  Напълно порьозни частици (FPPs)

 

01 юли, 2018

От Дейвид С. Бел, Ландън Уист, Шун-Хсин Лян, Дан Ли

LCGC Северна Америка / Том 36, брой 7, стр. 436–439

 

Използването на повърхностно порести частици (SPPs) в съвременната високоефективна течна хроматография (HPLC) е много често срещано явление. Първоначално SPPs се въвеждат като алтернатива на напълно порьозните частици (FPPs). През последните години много производители на колони са разработили 2-µm и по-малки SPP-базирани продукти. Тази статия изследва практическата полза от тях.

Въвеждането на модерни повърхностно порести частици (SPPs) от Advanced Materials Development през 2006 г. революционизира високоефективната течна хроматография (HPLC). Интересът към тези частици, характеризиращ се с твърдо ядро и порест външен слой, произтича от много високата ефективност, която те постигат при скромно обратно налягане (1). Преди появата на SPP усилията за подобряване на ефективността се фокусираха изцяло върху намаляване на размера на FPPs. Терминът течна хроматография с ултрависоко налягане, или UHPLC, е измислен от Йоргенсон през 1997 г. и се основава на проучвания с колони запълнени с 1–1.5 µm частици (2). През 2004 г. Waters въвежда първата търговска система за течна хроматография, способна да работи при налягания до 1000 bar, което комбинирано с наличието на колони, напълнени с частици под-2 µm, дава началото на ерата на UHPLC. Малкият размер на частиците - под-2 µm, води до високо обратно налягане на системата, което изисква инструментариумът да може да работи при такива условия. Именно повърхностно порестите частици (SPP) се доказаха, като алтернатива на по-малките напълно порьозни частици (FPPs). Колоните, напълнени със суб-3-μm SPP материали, осигуряват сходна ефективност на колоните напълнени с FPP под-2 µm, като работното налягане на HPLC системите се поддържа в граници до 600bar (3).

От първоначалното въвеждане на SPP колони с размер на частиците около 2.7 µm, много производители разработват стационарни фази, използвайки по-малки и по-големи частици, както и частици с различни порести структури. През 2014 г. Fekete и съавторите предначертаха една бъдеща тенденция за UHPLC - включването на под-2-µm SPP колони (4). Авторите отбелязват, че поради значителни подобрения в дифузията - умерено намаляване на надлъжната дифузия и известно подобрение на съпротивлението на масовия трансфер, SPP предлагат между 30 и 50% увеличение на ефективността при същите FPP частици, независимо от размера на частиците. Следователно повишаването на ефективността на по-малките SPP може да се очаква да е подобно на това, което се наблюдава при по-малките FPP. Също така беше отбелязано, че само две колони SPP с частици под 2-µm са търговски достъпни по това време.

 

В друга статия, Fekete и Guillarme оценяват 1.3-µm SPP фаза, отбелязвайки кинетичните предимства, пред напълно порьозните колони. Наблюдава се значителна ефективност от 500.000 терелки на метър в сравнение с 300.000, постигнати от добре напълнена FPP колона с частици под 2-µm. Авторите правят уточнение, че работата на SPP колоната е ограничена от текущата апаратура. Намаляването на извънколонните вариации и увеличаването на работното налягане на колоната и инструмента се отбелязват като потенциални подобрения.

 

DeStefano и съавтори отбелязват, че предимствата на по-малките SPPs включват по-висока ефективност, подобрена чувствителност при откриване, по-малко потребление на подвижна фаза по време на анализ, по-висок пиков капацитет и възприемане на най-съвременни технологии. Авторите отбелязват и следните недостатъци:

 

- По-малките частици се нуждаят от инструменти с по-високо налягане, с минимален извънколонен обем и връзки с малък вътрешен диаметър (конектори, повишено обратно налягане).

- Работата при високо налягане може да означава по-чест ремонт на оборудването.

- По-малките отвори на колоната могат да се запушат по-лесно от тези, които се използват при колони с по-голям размер на частиците.

- Колоните могат да не достигнат очакваната ефективност, тъй като по-малките частици са по-трудни за пълнене.

 

Авторите отбелязват, че по-малките частици осигуряват по-добро представяне при някои приложения, но предимството в ефективността не винаги е по-голямо от недостатъците (6).

 

Предлагането на колони от 2 µm и под-2-µm в средата на 2015 г. все още е ограничено. Advanced Material Technologies и Supelco въведоха линии от 2 µm колони с няколко модификации на повърхността. Phenomenex предлага и 1.3-µm (C18) и 1.7-µm версия на марката Kinetex. Thermo Fisher Scientific пуска на пазара фаза С18 с диаметър 1.4 µm, а Waters пуска платформа 1.6-µm с чист силиций и C18 (7). При обзора на пазара през 2016 г. не бяха въведени нови доставчици на SPP с 2-µm и под-2-µm. Само две допълнителни стационарни фази - Kinetex EVO-C18 и HALO Peptide ES C18 (Mac-Mod) (8) бяха разработени. През 2017 г. Agilent въведе редица варианти на 1.9-μm SPPs, включително чистия силициев диоксид за HILIC. ChromaNik въведе SunShell в 2-µm формат, Waters въведе 1.6-µm Cortecs с допълнителни вериги, а Phenomenex въведе 1.7-µm SPP колона, предназначена за охарактеризиране на РНК и ДНК (9). От този списък става ясно, че тенденцията към по-малки SPP частици наистина продължава.

 

Има много публикации през последните години за проучвания, използващи SPP фази за приложения в различни дисциплини. В прегледаната литература за тази част от "Column Watch" не могат да бъдат намерени "приложни" публикации, които конкретно да сравняват суб-3-µm SPP и суб-2-µm SPP фази. При систематична оценка на наличните в търговската мрежа UHPLC колони за профилиране на лекарствен метаболит, Dubbelman и съавторите откриват SPP с 1.3-µm и 1.7-µm, за да осигурят високоефективни сепарации. Налягането на системата при използване на 1.3-µm частици, обаче се отбелязва като проблем, когато се упражняват по-високи скорости на потока в опит да се съкрати времето на работа (10).

 

Фигура 1: Сравнение на 1,8- и 2,7- µm повърхностно порести колони от частици за разделяне на 34 перфлуорирани съединения. Колони: (а) Raptor С 18, 1.8 µm, (b) Raptor С 18, 2.7 µm; размери на колоната: 50 mm × 2.1 mm; мобилна фаза А: 5 mM амониев ацетат във вода; мобилна фаза В: метанол; градиент: 20-95% В за 6 min; скорост на потока: 0.4 mL / min; температура на колоната: 40 ° С; откриване: масспектрометрия.

 

Така че въпросът все още остава: "Трябва ли да се използват 2-µm или суб-2-µm SPP фази, или са достатъчни суб-3-µm SPP фазите?" Отговорът зависи от конкретния анализ. Например фигура 1 показва сравнително сложно разделяне на перфлуорирани съединения (PFC) както на 1.8- µm SPP, така и на 2.7- µm SPP. Много малка разлика се наблюдава по отношение на чувствителността, разделителната способност и формата на пика, което трудно оправдава използването на този метод при по-високо обратно налягане с 1.8-µm частици . Фигура 2 показва сравнение на 1.8-µm и 2.7-µm SPP-базирани бифенилови колони, използвани при разделяне на изкуствени подсладители. В този случай, фазата с 1.8-µm показва допълнителна разделителна способност спрямо тази с 2.7-µm . Колкото по-сложна е пробата, толкова по-голяма е вероятността за по-висока ефективност. Фигура 3 показва сравнение на трипсиновия разграждащ се албумин от говежди серумен албумин (BSA) както на 1.8µm , така и на 2.7 µm колона С18, базирана на SPP. С използването на по-малката SPP колона, ефективност се повишава.

 

 

Фигура 2: Сравнение на 1,8- и 2,7- µm повърхностно порести частични колони за разделяне на 11 изкуствени подсладители. Колони: (а) Раптор-бифенил, 1.8 µm, (Ь) Раптор-бифенил, 2.7 µm; размери на колоната: 50 mm × 2.1 mm; мобилна фаза А: 0.1% мравчена киселина във вода; мобилна фаза В: 0.1% мравчена киселина в ацетонитрил; градиент: 5-55% В за 3 min; скорост на потока: 0.3 mL / min; температура на колоната: 40 ° С; откриване: масспектрометрия.

 

Когато става въпрос за хроматография, отговорът на това дали трябва да влезем в сферата на SPP 2-µm и sub-2-µm е "зависи". Изглежда, че с увеличаването на сложността на разделянето, вероятността за нужда от допълнителна ефективност осигурена от по-малък по размер SPP, нараства. В други случаи обаче, добре елуираните съединения могат да изискват допълнителна ефективност, изискващи по този начин по-малки фази, базирани на SPP. На практика, използването на суб-3 µm SPP колони обикновено е подходящ компромис за разработване на методи. Приспособяването към по-малък (или по-голям) размер на частиците по време на оптимизацията на метода може да осигури подходящ краен метод.

 

 

Фигура 3: Сравнение на 1,8- и 2,7- µm повърхностно порести колони на частици за разделяне на смляната трипсин BSA. Колони: (а) Raptor ARC18, 1.8 µm, (б) Raptor ARC18, 2.7 µm; размери на колоната 100 mm × 2,1 mm; мобилна фаза А: 0.1% трифлуорооцетна киселина във вода; мобилна фаза В: 0.1% трифлуорооцетна киселина в ацетонитрил; градиент: 10-20% В за 6 минути, 20-40% В за 15 min; скорост на потока: 0.3 mL / min; температура на колоната: 60 ​​° С; откриване: масспектрометрия.

 

 

Източници:

(1) J.J. Kirkland, S.A. Schuster, W.L. Johnson, и B.E. Boyes, J. Pharm. Anal. 3, 303–312 (2013).

(2) J.E. MacNair, K.C. Луис и Дж. Jorgenson, Anal. Chem. 69, 983-989 (1997).

(3) V. González-Ruiz, A.I. Olives, и M.A. Martín, TrAC - Trends in Analytical Chemistry 64, 17-28 (2015).

(4) S. Fekete, J. Schappler, J.L. Veuthey, и D. Guillarme, TrAC - Trends in Analytical Chemistry 63, 2–13 (2014).

(5) S. Fekete и D. Guillarme, J. Chromatogr. A 1308, 104–113 (2013).

(6) J.J. DeStefano, B.E. Boyes, S.A. Schuster, W.L. Miles и J.J. Kirkland, J. Chromatogr. A 1368, 163–172 (2014).

(7) Д.С. Бел и Р.Е. Специалности, LCGC North Am. 33 (6), 386-395 (2015).

(8) Д. С. Бел, LCGC North Am. 34 (4), 242–252 (2016).

(9) Д. С. Бел, LCGC North Am. 35 (4), 226-239 (2017).

(10) A.C. Dubbelman et al., J. Chromatogr. A 1374, 122-133 (2014).