Dwight R. Stoll / 01 май, 2018

LCGC Северна Америка / Том 36, брой 5, стр. 304–311

В практиката ми, когато обучавам хора с по-малко опит в течната хроматография (LC), било то в промишлеността или в академичните среди, откривам, че едно от най-големите предизвикателства, пред което се изправям, е да накарам хората да оценят важността на доброто флуидно свързване в техните системи за LC. Добрите флуидни връзки са най-важни по пътя на потока от точката на впръскване на пробата от инжектора до точката на детектиране на аналита, включително връзките с инжектора, колоната, колонния термостат и детектора.

Ако са добре направени, повечето от тези връзки си остават затегнати, но връзките към колоната се развиват всеки месец или седмица, а може дори ежедневно, в зависимост от работната натовареност. Лошата връзка между колоната и останалата част от системата може буквално да унищожи доброто разделяне, така че е важно да се разберат факторите, които допринасят за "добрите" връзки. Днес на пазара наблюдаваме много производители на хроматографски консумативи, които въвеждат нови технологии за подобряване на качеството на тези връзки и вероятността за установяване на добра връзка се подобрява. Като потребители на тези технологии ние сме изправени пред много възможности за избор. Детайлното вникване в проблема трябва да ни помогне да вземем по-добри решения, които да ни служат добре. В тази статия ще направим преглед на основните принципи за направата на добри връзки, ще обсъдим какво се е променило през последните три десетилетия и какво е останало същото, както и ще опишем някои наскоро въведени технологии, които увеличават вероятността за направата на добри връзки.

Преглед на основните положения

Следва кратък списък на характеристиките на идеалната връзка между компонентите на една LC система:

• Без течове (днес до 20 000 psi или повече)

• Без празни или мъртви обеми

• Да няма изкривяване на свързаните части

• Връзката може да бъде прекъсната и повторно свързана многократно без това да се отрази на работата

• Евтини компоненти

Както при повечето неща в хроматографията, ние в крайна сметка правим компромиси. Това е така и при фитингите, и връзките за LC - не можем да имаме всичко, което искаме. Мисля, че правилото "Вие получавате това, за което плащате" се прилага най-вече тук, в смисъл, че трябва да платим повече за фитинги, които осигуряват добра производителност и удобство. Фигура 1 показва анатомията на типична метална връзка в LC система. Тази връзка може да бъде между клапан (колона) и свързваща капиляра, например. По-голямата част от консумативите на пазара имат за цел да се осъществи плътно затвряне и уплътняване между конусовидната втулка и конусовидната част на приемащия порт. Гайката задвижва този накрайник в порта, като осъществява херметичен контакт между двете повърхности (метал-метал, метал-полимер или полимер-полимер). В същото време компресията на конуса върху накрайника осигурява достатъчна сила, чрез която накрайникът ефективно се заключва на мястото, обособено за него.

Фигура 1: Схема на свързване с компресия на капиляра към клапан, порт на колоната, изход на помпата или вход на детектора: (a) изходящият край е прекалено дълъг, (b) изходящият край е твърде къс, (c) правилно монтирани капиляри.

Фигури 1а и 1Ь показват двете най-често срещани грешки, чрез които този процес на свързване може да се обърка. В първия случай – по-дългият край на капилярата предотвратява пълното придвижване на втулката в приемния порт, няма достатъчно контакт между накрайника и повърхността на порта, от което връзката ще протече. Тази ситуация най-често се дължи на използването на свързваща метална капиляра, която е предварително фиксирана (ферулата е заключена на различно място в резултат на предварително свързване с различен приемащ порт) до дълбочина на порта, различна от дълбочината на порта на текущата връзка. Фигура 2 показва, че дълбочината на пртовете варира в зависимост от производителя, като разликите са до няколко милиметра. Във втория случай (Фигура 1Ь) накрайникът е позициониран твърде близо до края на капиляра, като този път се получава нежелан празен обем. Това неправилно позициониране и допълнителния празен обем може отново да се дължи на преместване на капиляра с вече фиксиран край от един порт към друг или дори от развиване и повторно свързване към същия порт. Нежеланият допълнителен обем неизбежно причинява развлачване на хроматографските пиковете. Дали това води до измеримо увеличение на ширината на пика или промяната на формата на пика ще зависи от редица фактори: размера на празния обем; ефективността на колоната или условията на експеримента. Този ефект обикновено се проявява като допълнителна опашка на хроматографския пик и е най-силно изразен при първите елуирани съединения. Фигура 3 показва точно такъв пример, където се наблюдава много дълга опашка, породена от нарочно оставена малка кухина във връзката на колоната чрез използване на неправилно поставена втулка. Наличието на опашки може да бъде много проблематично в случаите, когато пик с ниска концентрация се елуира в опашката на съседен пик с голяма концентрация, следователно анализът е компрометиран поради лошата връзка. В моята лаборатория сме направили видео с инструкции, което помага на начинаещите хроматографисти да разберат правилната процедура за установяване на добра връзка. Няколко примера за такива демонстрации могат да бъдат намерени и онлайн (2).

Фигура 2: Форми на втулки и дълбочини на портовете, свързани с връзки към части от различни производители: (a) Swagelok, (b) Waters, (c) Valco, (d) Parker, (e) Rheodyne,

Някои неща остават същите, но...

Основните принципи, свързани с добрите връзки в LC, не са се променили от дните на ранните системи за високоефективна течнахроматография (HPLC). Наистина, изображенията, показани на фигури 1 и 2, са много сходни с тези, използвани от Джон Долан и неговите съавтори в ранните издания, касаещи отстраняването на проблеми в течнохроматографските системи, написани през 1980 г. (3,4). Бих искал да коментирам конкретно тук три аспекта, които оттогава са се променили доста.

Фигура 3: Сравнение на получените хроматограми с добри свързвания на колоната (сини) и връзки с малък празен обем, въведен съзнателно (червено).

Самостоятелно рязане на връзките

В статията си от 1984 г. (3), Долан насърчава закупуването на предварително отрязани капиляри, но дава съвети и за правилното рязане на метални капиляри. Имаше време, когато самият аз изрязвах металните капиляри, но в последствие тези капиляри бяха ужасни. Като се има впредвид сравнително ниската цена на металните капиляри, които се използват днес, както и потенциалът за сериозна дисперсия на пика, която може да бъде внесена от лошо изрязване, е трудно да се оправдае собственоръчното рязане на връзки. При полимерните връзки, обикновено направени от PEEK за налягане до около 5000 psi, нещата са различни. В този случай е сравнително лесно да се направи добър, чист и квадратен разрез с помощта на нож, проектиран за тази цел, който се предлага от повечето доставчици на консумативи. В моята лаборатория използваме много капиляри от PEEK, особено в случаите, когато експериментираме с различни конфигурации на инструмента. След като се установи конфигурация, която харесваме, подменяме всички PEEK връзки с метални капиляри, защото ги смятаме за най-надеждни във времето.

Взаимозаменяемост на фитингите и многократни връзки

В статия от 1988 г. (4) Долан твърди, че конкретния вид на втулката не е от значение, ако дълбочината на капилярата (вж. Фигура 1) съответства на приемащия порт, тъй като формата на накрайника съответства на формата на порта. Въпреки това по-големият проблем на практика е, че може да се внуши, че капиляра с подвижна свръзка може да се премести от един порт към друг (например, от клапан към колона, или от една към друга колона) без никакви проблеми. От днешна гледна точка преместването на капиляри с предварително подготвени фитинги е неоправдано рисковано. Развиване на капиляра от клапанния порт и повторното му свързване с един и същи порт може да работи до няколко пъти, но в крайна сметка тази практика ще доведе до малки течове и за това трябва да се следи внимателно. Като се имат впредвид изискването за реализиране на пълния потенциал на съвременните хроматографски колони, преместването на капиляра от една колона към друга е по-скоро рисковано, отколкото безпроблемно. Систематичното проучване на този въпрос от Станкович, Гуйохон и колеги ясно показва колко сериозен може да бъде този проблем (5). Те установявят, че повторното използване на един и същи предварителен фитинг за свързване към колони от три различни производителя със сходни конструкции, въвежда допълнителна дисперсия на пиковете от 7 µL²! Имайки впредвид, че това ниво на разширение се случва в самата колона, проблемът с монтажа може да доведе до загуба на ефективност от порядъка на 50% или повече. Най-ефективният начин за избягване на тези проблеми е просто да се използва нова капиляра, когато се прави нова връзка, така че краят да е фиксиран и адаптиран към съответния порт. Разбира се, при този подход има голямо оскъпява с многото промени в системата. В моята лаборатория, ние внимателно проверяваме за течове, когато преправяме връзките към клапаните и помпите, използвайки предварително фиксирани фитинги. При свързване към колони никога не използваме фитингите показани на фигура 2. Вместо това използваме по-новите типове (обсъдени подробно по-долу), които са предназначени да бъдат използвани многократно и да правят добри връзки всеки път.

Fingertight фитинги

Така наречените fingertight (навиващи се на ръка) фитинги са много привлекателни за практикуващите LC, просто защото е удобно и бързо да се направи нова връзка с колона или друг компонент на инструмента без гаечни ключове. Много доставчици на консумативи рекламират фитинги, които са херметични до налягания в системата от порядъка на 20 000 psi без необходимст от гаечни ключове. В моята лаборатория установихме, че някои от по-новите двукомпонентни монтажни конструкции са подобрение в сравнение с по-старите и са надеждни до около 10 000 psi без да се използват гаечни ключове. Отново, с това удобство идват и повишени разходи. За операции с много високо налягане до 20 000 psi, все още смятаме, че най-надеждни връзки са металните, натегнати с гаечни ключове.

Последни тенденции в технологията за свързване

Преди две десетилетия, когато традиционната колоната имаше параметри 5-µm порьозни частици, 150 mm × 4,6 mm ID, самата тя допринасяше много за дисперсията на наблюдавания пик. От тогава технологиите използвани при съвременните хроматографските колони са се подобрили значително. Възникнала е необходимост от надеждни връзки при високо налягане и многократно свързване на една и съща капиляра или накрайник с различни видове колони. Две напълно различни иновации са въведени сравнително наскоро, за да отговорят на тази изисквания: Quick Connect фитинг (Agilent Technologies) и Viper фитинг (Thermo Fisher Scientific). В първия случай връзката има вътрешен пружинен механизъм, който гарантира, че капилярният ствол е притиснат към дъното на приемащия порт, когато фитингът е затегнат. Този механизъм увеличава вероятността за правилно свързване всеки път, като се избягва мътрвият обем от фигура 1b. Полимерната втулка на фитинга е съобразена и с леки промени в формата на порта, което позволява многократното и използване без наличието на течове.

Хроматограмите, показани на фигура 4, показват, че този нов дизайн може да осигури същата висококачествена връзка с колоната, която очакваме от конструкцията на металните капиляри, тъй като не се наблюдава голяма пикова следа, получена от лоша връзка (фиг. 3). Освен това хроматограмите показват, че тази висококачествена връзка може да бъде затягана многократно, като се използва един и същ монтаж без никакви загуби на производителност.

Фигура 4: Сравнение на хроматограми, получени с прясно свързани неръждаеми стоманени фитинги (виж фигура 2) и фитинги за бързо свързване преди и след множество връзки.

Накрая, на фигура 5 е показана конструкцията на връзката (Viper), базирана на подход, който е напълно различен от конусовидните фитинги. В този случай, уплътнението между капиляра и приемащия порт е направено в самото дъно на портата, което увеличава вероятността за свързване без празен обем. Както и при предишната конструкция, уплътнителният компонент е полимерен, което позволява многократно използване на връзката без загуби на производителност. Тези предимства и удобства отново се отразяват върху цената на съответния консуматив.

Фигура 5: Конструкция на Viper монтажа, която прави уплътнение между свързващия капиляр и дъното на приемащия порт, вместо да се използва уплътнение на основата на накрайника.

Обобщение

Практикуващите LC се сблъскват с голям брой избор на връзки, които могат да се използват за свързка между компонентите на системата. Потребителите трябва в крайна сметка да решат коя технология предлага най-добрия компромис по отношение на производителността и разхода за всяка конкретна ситуация. За специализираните LC системи, където реконфигурацията на системата е рядка, традиционните метални фитинги обикновено предлагат най-добрия компромис на разход, надеждност и качество на връзките. За свързване към колони, особено когато те се сменят често, много удобни са фитингите за многократно свързване, които не изискват използване на метален накрайник към капиляра. Технологиите, въведени от няколко производителя през последните години, подобриха дизайна на тези многократни приспособления и сега има многократни връзки с високо качество дори при много високо налягане. Тези технологии идват с по-високи разходи, но подобрението на производителността и лесната употреба, която те предоставят, ще надвишават разходите в много ситуации.

Източници:

(1) T. Li, D. Zeko, and M. Fuehrer, "Optimizing HPLC and UHPLC Performance with Agilent A-Line Quick Connect Fittings," presented at Analytica 2014, Shanghai, China, 2014.

(2) https://youtube/iTilOMH51Uc.

(3) J.W. Dolan and V.N. Berry, LC Magazine 2, 20–21 (1984).

(4) J.W. Dolan and P. Upchurch, LC Magazine 6, 788–790 (1988).

(5) J.J. Stankovich, F. Gritti, P.G. Stevenson, and G. Guiochon, J. Sep. Sci. 36, 2709–2717 (2013). doi:10.1002/jssc.201300175.

(6) F. Steiner, T. Piecha, T. Fehrenbach, and F. McLeod, "Ensuring Best Possible UHPLC Performance Through an Innovative Capillary and Fitting Design," presented at Pittcon 2010, Orlando, Florida, 2010.