От Дъглас Е. Рейни
LCGC Северна Америка / 36, бр. 8, стр. 494–497
Когато преподавам курс по инструментален анализ, един от любимите ми експерименти е, когато учениците получат бутилка тоник, а след това изследват урината след консумацията му. Използва се течно-течна екстракция, за да се определят нивата на уринарен хинин чрез флуоресцентна спектроскопия.
Експериментът дава чудесен пример за явленията адсорбция, разпределение, метаболизъм и екскреционен феномен, което е важно за фармакологията и токсикологията. Преди да консумират тонизиращата вода, учениците трябва да вземат проба от урина, която да се използва като празна, тъй като урината може да съдържа ендогенно съединение, което да флуоресцира както хинина. Изненадващо, макар студентите да събират, приготвят и анализират празната проба по подходящ начин, те често не извличат нищо полезно от данните, които получават.
Идеята за празни проби (blanks) - проби, които не съдържат аналит и които се използват за определяне или проследяване на източника на замърсяване или деградацията на пробата изглежда проста и ясна. Въпреки това съвсем наскоро беше отбелязано, че дори ASTM International (чрез Комисия D19) все още се бори с определянето на съставните елементи, които трябва да присъстват (1). Тъй като празните проби се използват за проследяване на източници на изкуствено внесено замърсяване, e важно да се разгледа нуждата от специфични празни проби, характерни за дадения тип анализ. Впоследствие може да се окаже, че е необходимо разработването на няколко различна вида празни проби.
Празните проби играят важна роля в количествения анализ и често се изискват от регулаторните агенции като част от схемите за контрол на качеството. Статията от този месец изследва различните видове празни проби и тяхното използване, за да се осигури по-нататъшно разбиране на схемите за подготовка на проби. Например, правилното използване на празни проби наскоро разреши една загадка в нашата лаборатория. Беше трудно да се определи източника на замърсяване при анализиране на проби със свръхвисокоефективна течна хроматография(UHPLC), докато не се използва празна проба от разтворител (реагент), с което беше установено, че неопитните аналитици са внесли замърсител директно в бутилката с ацетонитрил използван за подвижна фаза.
Видове празни проби
Празните проби се събират, съхраняват, обработват и анализират по начин, близък до този на автентичните проби, доколкото е възможно, за да се вземат предвид замърсителите и други фактори, които могат да окажат въздействие и унищожаване на пробата. Всеки аналитичен сигнал, дължащ се на празна проба, които липсва в разтворителя, може да бъде приписан на замърсяване. Правилното боравене и обработка на празните проби е абсолютно необходимо, тъй като в много случаи аналитичните резултати се изчисляват чрез изваждане на приноса на празната проба към аналитичния сигнал. Тъй като празните проби могат да се анализират по всяко време от аналитична схема, те могат да отчитат различни елементи, които могат да възникнат по време на анализа. Ето защо е важно правилно да се разбере използваната терминологията и потенциала на тези празни проби. По-долу са изброени примери за различни типове празни проби, събрани от US Geological Survey (USGS), Агенция за опазване на околната среда (EPA) и уебсайтове на Агенцията по храните и лекарствата (FDA):
-Празна проба за околната среда (Ambient blank): Празна проба, поставена в типа контейнер, използван за автентичната проба, отворен по време на вземането на пробата и изложен на околната среда.
-Калибровъчна проба (Calibration blank): Тази проба без аналит се използва с приготвени стандарти за калибриране на аналитичния инструмент (установяване на "нулева" стойност) и за потвърждаване на липсата на смущения в аналитичния сигнал. Важно е да се отбележи, че тази празна проба е различна от полевата проба (Field blank) описана по-долу, но може да се използва в комбинация с нея, за да се идентифицират източниците на замърсяване.
-Проба за оборудването (Equipment blank): Празна проба, която се обработва чрез оборудването за проби, обикновено по време на събиране, по начин сходен с този на реалните проби.
-Полева проба (Field blank): Общ вид празна проба която е и най-изчерпателна. Тя се подлага на събиране, транспортиране, запазване, съхранение и лабораторен анализ. Полевите заготовки могат да определят замърсители, аналитични грешки, или отклонения, произтичащи от събирането на проби и последвалия анализ. Такова замърсяване може да се получи от бутилки и други изделия от стъкло, оборудване за вземане на проби, условията, консерванти, транспорт и съхранение или от лабораторните анализи.
-Филтърна проба (Filter lank): Много специфичен вид заготовка, където празната проба се филтрира през същия апарат, използван за обработка на автентични проби.
-Празна проба със стандртна добавка (Fortified method blank): Използва се проба за метода (виж по долу), като към нея се добавя аналит. Не бива да се бърка с пробите със стандартни добавки, използвани за определяне на аналитичния добив. Тези проби се използват за оценка на разграждането на аналита по време на аналитичните процедури.
-Матрична проба (Matrix sample): Тези проби съдържат всички компоненти, с изключение на аналитите, които представляват интерес. Преминават през всички етапи на обработка на пробата. Те се използват при наличието на значителни смущения от матрицата.
-Проба за метода (Method blank): Пробите за метода се използват за определяне на фоново замърсяване или смущения в аналитичната система. Подобно на други празни проби, те се състоят от матрицата на пробата, и използваните реактиви в аналитичната процедура без самият аналит.
-Празна проба за консервант (Preservation blank): празна проба, третирана с консерванти, използвани в аналитичната схема. Когато се сравнява с празна проба без консервант, може да се определи ефекта на този агент.
-Проба за реактива (Reagent blank): Фоновите смущения и замърсяването от използваните химикали и аналитични системи се измерват с реактивни проби. Всички аналитични реактиви се добавят към празната матрица в същата пропорция, посочена в аналитичния метод, но не преминават през цялата схема за анализ.
-Пътуваща проба (Trip blank): Празна проба, взета по време на пробовземането, за да се анализират промените в пробите протекли по време на прехвърлянето им от мястото на пробовземането до лабораторията. Приготвят се по време на събирането на пробите и са особено ценни за летливи съединения, светлочувствителни компоненти, бактериално разлагане или разлагане при цикъл на замразяване-размразяване.
Фигура 1 показва връзката между най-често срещаните типове празни проби и тяхното покритие - т.е. зоната, за която те се отнасят. (включително матрица на пробите, реактиви и оборудване) (2). Важно е да се отбележи, че празните проби са различни от референтните проби, контролните проби, набодените проби и репликираните проби, всяка от които служи за отделна цел. Съгласно стандартите на EPA (3) приемливите празни проби имат целеви концентрации на аналита по-малки от половината от лимита за количествено определяне (LOQ). Съществуват изключения за проби, съдържащи нива на аналит, по-високи от допустимите граници, и критериите за избор на проба могат да варират между регулаторните методи. По подобен начин, празните проби за метода се изпълняват периодично в рамките на всеки набор от извадки, за да се оцени пренасянето на пробата.
Фигура 1: Описание на покритието, от извадката до лабораторията до полето, на различни източници на замърсяване и заготовки за проби, използвани за отчитането им (изменено от референция 2).
Детекторните сигнали, причинени от празната проба, могат да доведат до усъвършенстване на схемата за анализ. Загубата на проба, получена при изпаряване, например, може да наложи промени в събирането, транспорта или съхранението и. Смущениябиват два вида. Адитивните смущения се причиняват от замърсители, добавени към пробата в значително количество. Например, ако даден обем разтворител се използва за дадено количество на пробата, независимо от концентрацията на аналита, и този обем на разтворителя внася замърсители, то налице са адитивни интерференции. Ако замърсителят не може да се определи и отстрани, се прави предположението, че сигналът, причинен от замърсителя, може да бъде изваден от наблюдавания аналитичен сигнал. В такъв случай получените резултати трябва да бъдат обозначени като коригирани. Мултипликативните смущения са резултат от различия в количеството на замърсителя, дължащо се на неговия източник. Например, когато се използват различни аликвотни обеми при прехвърляне на пробата или при приготвянето и, концентрацията на аналита се увеличава, както се увеличават и нивата на замърсителите. Тези смущения могат да бъдат коригирани само чрез методи за разделяне или селективно откриване. При определяне на смущенията се използва фиктивен анализ, като се инжектира празна спринцовка (въздух) в газов хроматограф. Това може да помогне да се проследи естеството на интерференцията (4).
Независимо от това как се обработва е ясно, че сигналът от празната проба става особено важен при ниски концентрации на аналита. По този начин той има роля в определянето на най-малкото количество аналит, което може да бъде открито (LOD). Armbruster и Pry обсъждат три дескриптора на това най-малко количество откриваем аналит (5). Границата на празната проба (LOB) идва от повторен анализ на празни проби, които не съдържат аналит и е най-високата очевидна концентрация на аналита от този анализ:
LOB = среден + 1.645 (SDblank).
Границата на откриване (LOD) е най-ниската възможна концентрация за детектиране на аналит, различаваща се от LOB:
LOD = LOB + 1.645 (проба за концентрация SDlow concentration sample )
Границата на количествено определяне (LOQ) е по-голяма или равна на LOD и представлява количеството на аналита, което може да бъде надеждно открито при предварително определени нива на точност (измерено като стандартно отклонение или други статистически методи). Фигура 2 графично изобразява статистическата връзка между тези граници. Ясно е, че познаването на LOB е необходимо за установяване на граници на откриване.
Фигура 2: Статистическа връзка между LOB, LOD и LOQ (възпроизведена от референция 5). Ширината на разпределението около всяка стойност е показател за статистическа прецизност и при 95% доверителен интервал съществуват някои общи стойности между всяко ограничение.
Примери на приложения от определянето на празни проби
В първите параграфи в тази статия забелязахме два примера за използването на празни проби. Пробата от урина, събрана преди консумацията на тонизираща вода, е матрична празна проба. Ако приемем, че концентрацията на ендогенната интерференция, когато е коригирана за специфично тегло, е постоянна по време на периода на събиране на пробата, ендогенният интерферент е интерференция на добавката, а празната проба или фон може да бъде изваден от аналитичното измерване. В случая на замърсения ацетонитрил, причиняващ фалшиви пикове в UHPLC хроматограмата, ацетонитрилният замърсител е мултипликативна интерференция. Количеството използван ацетонитрил варира с размера на пробата, и въпросът се разрешава чрез използване на пресен, незамърсен разтворител.
Нека разгледаме един последен пример. Земеделски производител, който желае да анализира разпространението на торове, приложени към дадена област, сключва договор с аналитична лаборатория за тази работа. Общо 50 проби от почвата са събрани в решетъчен модел на участък (640 акра) земя. При прегледа на резултатите от анализа, всички проби показват статистически сходно ниво на прилагания тор, с изключение на една проба, която докладва резултати 15 пъти по-големи от другите. От чисто статистическа гледна точка, може да се проведе Q-тест или друг тест, за да се определи, че тази голяма стойност е отклонение, което може да бъде отхвърлено. Подобен статистически тест обаче не би отговорил на няколко възможни реални сценария. Ами ако това място беше мястото, където фермерът презареждаше пръскачката? Какво ще стане, ако местната среда има различен отток от останалата част от полето или различен състав на почвата? Правилното използване на подходящи празни проби, както и повторно вземане на проби и тяхното анализиране, могат да бъдат използвани за откриване на потенциалните причини за тази единствена висока докладвана стойност.
Заключение
Празните проби, заедно с няколкото разработки на пробата, стандартите и пробите със стандартни добавки, са от решаващо значение за качествения контрол и разработването на стабилни количествени аналитични методи. Времето необходимо на аналитиците да разберат видовете празни проби, тяхната нужда (какво те могат да коригират) и тяхното използване, си заслужава.
Източници:
(1) D. Coleman and L. Vanatta, Amer. Lab. 42(10), (2010) (https://www.americanlaboratory.com/914-Application-Notes/1114-Part-40-Blanks/). https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-06/documents/blanks.pdf
(2) EPA Method SW-846 Update V Revision 2, July 2014 (https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-10/documents/chap1_1.pdf).
(3) M.F. Vitha, P.W. Carr, and G.A. Mabbott, J. Chem. Educ. 82(6), 901–902 (2005).
(4) D.A. Armbruster and T. Pry, Clin. Biochem. Rev. 29 (Supple 1), S49–S52 (2008).
