Джон Долън

Jan 01, 2015 - LCGC North America (Vol. 33, 1, 18–22)

Докато провеждам обучения по течна хроматография в целия свят, никога не спирам да се изненадвам с някои от най-креативните практики, въвеждани от студентите, които могат да доведат до проблеми с хардуера на HPLC системите или с аналитичния метод. Някои от тях могат да бъдат класифицирани като хроматографски НПТ (Не Правете Това) и поради това бих искал да споделя седем от тях в това издание на рубриката „LC Troubleshooting“. Разглеждайте ги като предпазни мерки, съобразяването с които би направило практиката ви в лабораторията далеч по-приятно изживяване. Те не са представени или класирани по значимост.

НПТ 1: Не коригирайте рН на разтвори с органични разтворители

Има три начина за приготвянето на буфер и коригиране на неговото рН: правилен, лесен и неправилен. Нека приемем, че искаме да приготвим 1L ацетатен буфер с рН 4.0 и концентрация 20mM. Правилния начин за приготвяне на този буфер би бил да отмерим определени количества оцетна киселина и натриев ацетат съгласно упътванията на някои от онлайн калкулаторите (напр. http://www.zirchrom.com/Buffer.asp) и да ги разредим до 1L в мерителна колба. Алтернативен подход е да приготвим разтвори на оцетна киселина и натриев ацетат с концентрация 20mM и да ги смесваме до постигане на желаното рН 4.0. И по двата метода бихме получили желания 20mM ацетатен буфер с рН 4.0. По-лесния начин за приготвяне на същия буфер е да си приготвим разтвор на натриев ацетат с концентрация 20mM и да го титруваме с концентрирана оцетна киселина до рН 4.0. Резултата ще е малко повече от 1L ацетатен буфер с рН 4.0, но концентрацията няма да е точно 20mM, тъй като при титруването сме използвали концентрирана киселина. Би ли имало значение? Обратнофазовите разделяния не са много чувствителни към концентрацията на буфера при условие, че тя е над минималния праг (5–10 mM в повечето случаи) и е малко вероятно лесния начин за приготвяне на буфера да доведе до получаване на различни хроматографски резултати от тези при използване на приготвен по правилния начин буфер. Въпреки това йонообменната, HILIC и някои други видове течна хроматография, където йонните взаимодействия са важни за хроматографското разделяне, могат да бъдат чувствителни към малки промени в концентрацията на буфера. Така че в тези случай може да наблюдаваме отчетливи разлики в разделянето при използване на буфери, които сме приготвили по два различни начина. Който и начин за приготвяне на буфера да изберете, той трябва да бъде описан в документацията на аналитичния метод, за да е възможно получаването на едни и същи резултати при извършване на анализа от различни хора.

Грешния начин да приготвите подвижната фаза е да нагласите рН след като водния буфер е смесен с органичния разтворител, напр. с метанол или ацетонитрил. Когато в разтвора присъстват органични разтворители, рН-метрите дават различни резултати от тези, когато се измерва рН само на водни разтвори. Нещо повече – тези стойности могат да варират в зависимост от температурата в лабораторията по начин, който не може да бъде компенсиран правилно от хардуера и софтуера на рН метъра. Използването на такъв буфер може да доведе хроматографски резултати, които са различни от тези, получени с приготвен по първите два начина буфер. Спомням се един проект от моята практика, при които анализите с даден метод се извършваха предимно през лятото и много по-рядко през зимата. Лабораторията беше разположена в слабо отоплявано производствено помещение, рН на подвижната фаза се нагласяше след прибавяне на органичния компонент, и разликата в действителното рН беше достатъчна за получаването на различни хроматограми при анализите, извършвани през зимата.

Когато се описва състава и рН на подвижната фаза в течната хроматография, обичайно трябва да се позоваваме на рН на съдържащ единствено вода буфер, и да игнорираме какво се случва при прибавянето на органичния разтворител. Да, очевидно рН ще се промени след добавянето на органичния разтворител, но тази промяна ще става по един и същ начин всеки път и това няма да се отразява на хроматографските резултати. НПТ 1 ни напомня никога да не коригираме рН на подвижната фаза след като в нея вече е прибавен органичния компонент.

НПТ 2: Не използвайте една и съща колона за различни методи

Когато имате два HPLC метода с едно и също описание за колоната, най-добре е да не използвате една и съща колона и за двата метода. По-добрия подход е да купите две отделни колони и да използвате всяка от тях за даден метод. Може да ви се струва, че не е лошо да използвате една колона за два различни метода, но рано или късно ще се откриете случаи, при които маловажни пикове от единия метод, напр. пикове на онечиствания, помощни вещества или късно елуиращи се съединения, ще създадат проблеми при анализите с втория метод. Този ефект може да бъде най-отчетлив когато единия метод е за определяне на аналити с високи концентрации, (напр. анализите за еднородност на съдържанието), а втория метод е за разпадни вещества или замърсявания с ниска концентрация в друг продукт. Въпреки това, понякога проблем се появява и когато една и съща колона се използва за два различни метода за анализ на един и същ продукт. Когато за всеки отделен аналитичен метод използвате отделна колона, предимството е, че като цяло годишните ви разходи за колони се намаляват. НПТ 2 ни препоръчва да използваме една колона само за даден аналитичен метод.

НПТ 3: Не разработвайте нов аналитичен метод върху вече използвана колона

Нека си го кажем направо – колоните са скъпи и много от нас не разполагат с лукса да поставят чисто нова колона на HPLC системата всеки път, когато искаме да проверим възможностите на тази колона при разработване на метод. Пробвайки слабо използвана колона при експериментите с различни колони не би трябвало да е проблем. Въпреки това, след като веднъж изберете дадена марка и модел колона като сериозна възможност за постигане на заложените хроматографски параметри на разделянето, инсталирайте чисто нова такава колона за продължаване на работата по разработване на метода. В прекалено много случаи колона, която е била използвана за други цели или метод, може да няма вече същите химични свойства като същата колона като нова (вж. НПТ 4 по-надолу). Представете си обземащото ви чувство на неудовлетвореност, ако прекарате няколко седмици в разработване на задоволителен аналитичен метод само за да откриете, че той не работи с чисто нова колона. Просто не си струва риска. НПТ 3 ще ни помогне също така да избегнем нежелани промени по метода по-късно в процеса на неговото разработване.

НПТ 4: Не използвайте колона за метод с йонни двойки за анализи без йонни двойки

Това предупреждение върви ръка за ръка с НПТ 2 и НПТ 3. Реагентите за йонни двойки, особено по-хидрофобните от тях като сулфонатите с по-дълга верига, никога не се премахват напълно от колоната по време на нейното измиване или регенериране. Например в едно от изследванията (1) само около половината от лаурил сулфата бива измит от С18 колона след промиване с над 700 колонни обема (1L) 20:80 метанол-фосфатен буфер. Авторите не са успели да премахнат напълно всичкия реагент за йонни двойки дори със 100% метанол или изопропанол. Реагентите за йонни двойки с по-къса верига се отмиват по-лесно, но е разумно да приемем, че веднъж навлязъл в колоната, реагента за йонни двойки никога няма да бъде напълно премахнат от нея. Следите от останалия в колоната реагент могат да променят нейната химия достатъчно, че тази колона вече никога да не бъде еквивалентна на чисто новата такава. В такива случаи важат НПТ 2 и НПТ 3. НПТ 4 ни напомня да играем на сигурно и да не използваме колона, на която са използвани йонни двойки за метод без йонни двойки.

НПТ 5: Не допускайте, че всички С18 колони са еквивалентни

В миналото приемахме, че всички С18 колони дават еквивалентни разделяния. Всъщност USP (United States Pharmacopoeia) има L- класификация, която описва колоните за течна хроматография съгласно тяхната химична структура. Според USP всяка една колона със свързана върху силикагел или керамика фаза С18, със или без деактивация на пълнежа, e L-1 колона. По-опитните хроматографисти знаят, че случая не е такъв, но това не е очевидно за наскоро започналите. Пример за това се вижда на Фиг. 1 при сравняване на различните хроматограми. Повечето специалисти ще се съгласят, че колоната на производител А генерира еквивалентно с колоната на производител B разделяне, въпреки че времената на задържане не са точно едни и същи. От друга страна хроматограмата, генерирана от колоната на производител C, е видимо различна от останалите две колони. И въпреки това и трите колони се водят L-1 колони според USP. НПТ 2 ни предупреждава да бъдем внимателни когато използваме каквато и да е колона, която се различава по марка и модел от указаната за дадения аналитичен метод.

Фиг. 1: Разлики в селективността между с18 колони на 3 различни производителя (по данни от цит. 2).

НПТ 6: Не доливайте бутилката с буфера на подвижната фаза

Буферите, които се използват при HPLC анализи, като ацетатни и фосфатни, могат да създадат привлекателна среда за развитието на микроорганизми. В нашата лаборатория един път тествахме различни буфери, за да видим колко време ще издържат, преди в тях да се появят значителна популация микроорганизми. Бутилките с различните буфери бяха оставени на перваза на прозореца и наблюдавани от време на време. Нашите заключения бяха, че ние вероятно бихме могли да използваме буферите в продължение на две седмици, преди да се наложи да бъдем засегнати, и така използвахме консервативния подход , като определихме срока на годност за всички буфери на 1 седмица след тяхното приготвяне. Предполагам, че много колеги биха могли да използват буферите си и повече, но това зависи от буфера, неговото pH и показателите на лабораторната среда. И все пак, без значение какви предпазни мерки ще вземете, микроорганизмите вероятно ще запознат да растат в бутилката с буфера. Ако не подменяте бутилката с чиста всеки път, когато поставяте отново буфер на HPLC системата, вие просто заразявате иначе новата подвижна фаза с микроорганизмите, живеещи в останалите няколко милилитра от стария буфер. Това е особено сериозен проблем при UHPLC, тъй като за колоните там се използват входящи фрити с порьозност 0.2µm - достатъчно фини, за да бъдат блокирани от бактерии. По-добрата от доливането практика е да замените бутилката с нова и чиста всеки път, когато се приготвя нов буфер. НПТ 6 ни напомня да не замърсяваме прясно приготвените буфери.

НПТ 7: Не се стискайте за стотинки, които ще ви струват левове

Удивен съм колко често игнорираме икономическите реалности в HPLC лабораторията. Най-скъпото нещо в лабораторията сте вие – ако не го вярвате, питайте шефа си. Това означава, че е необходимо да действаме разумно, когато се опитваме да спестим разходи. Един пример за недостатъчно добра преценка е свързан с героичните усилия да се удължи живота на колоните за течна хроматография. Наскоро прочетох в една от онлайн групите за дискусии доста съвети в тази посока. Те включваха измиване на колоната със силни разтворители като дихлорметан или използване на разтворители за протеини. Тези практики почти никога не връщат колоната към първоначално генерираната и ефективност и могат да отнемат доста време, особено когато се мие със последователности от взаимосмесващи се разтворители. Много пъти съм казвал в поредицата „LC Troubleshooting“, че ако вие постигате 500-600 анализа върху колона за 500-600 долара, то разходите за колоната излизат по 1 долар на проба и от тази гледна точка колоната не е скъпа. Като разбрахме наскоро (3) почти ¾ от потребителите извършват най-малко по 500 анализа с една колона, а почти половината използват една колона най-малко за 1000 анализа. Важно е всяка колоната да бъде добре измивана след всяка серия проби, и може би от време на време да се промива в обратната посока, но нищо повече от това няма да допринесе съществено за удължаване на работния и живот. НПТ 7 ни казва, че е необходимо добре да преценим истинската стойност на това да се опитваме да възстановим някой компонент или част от HPLC системата, вместо да го подменим с нов.

Заключение

Разгледахме седем неправилни практики, които се срещат в много лаборатории. Нека опитаме да ги променим и превърнем в добри лабораторни практики, които са смислени и помагат за подобряване продуктивността на лабораторията.

Литература

(1) J.H. Knox and R.W. Hartwick, J. Chromatogr. 204, 3–21 (1981).

(2) L.R. Snyder, J.W. Dolan, D.H. Marchand, and P.W. Carr, Adv. Chromatogr. 50, 297–376 (2012).

(3) J.W. Dolan, LCGC North Am. 32(12), 916–920 (2014).