За разлика от изократните разделяния, градиентното елуиране понякога може да изглежда неинтуитивно. Въпреки, че от подходяща перспектива, нещата, които интуитивно разбираме за изократните методи, важат по сходен начин и за градиентите.

В много от публикуваните напоследък материали в сериите "LC Troubleshooting," ние сме разглеждали течната хроматография (ТХ) с градиентно елуиране в различен контекст. Съвсем наскоро (1) обсъждахме как може да се ускори работата по разработване на метод чрез използване на „сондиращ“ анализ (scouting run). Други случаи сме разглеждали специфични проблеми при градиентните методи, както и други аспекти на градиентното елуиране. Аз няма да полагам усилия да крия факта, че съм пристрастен към използването на градиенти – те наистина имат потенциал да са по-бързи, с по-ниски нива на откриване и са по-гъвкави за фина настройка в сравнение с изократното елуиране. Разбира се, има и много проблеми, с които можем да се срещнем при работа с градиенти. Някои от тях са присъщи за техниката и могат да бъдат избегнати или минимизирани с полагане на малко грижи. Други проблеми са резултат от слабото разбиране на градиентното елуиране или от небрежна работа в лабораторията. Но тъй като широкия диапазон от теми прави невъзможно тяхното подробно обсъждане в една статия, ние ще разглеждаме по няколко аспекта на градиентното елуиране в серия от публикации. Този месец ще се концентрираме върху това как можем да пренесем нашето интуитивно разбиране за изократните разделяния към подобно разбиране за градиентното елуиране. Ако искате повече детайли върху тази тема или каквото и да било свързано с градиентите в ТХ, цитираната литература (2) представлява обсъждане на градиентното елуиране в много и различни детайли.

Изократно – толкова е просто!

Вярвам, че една от причините обратнофазовата ТХ да е толкова популярна техника е интуитивната природа на изократните разделяния. Подвижната фаза обикновено се състои от воден и органичен компонент. По принцип водната фаза е буфер или вода, докато като органичен компонент обикновено се използва ацетонитрил или метанол. Водната фаза е слабия разтворител, често наричан Фаза А, а органиката е силния разтворител, или Фаза Б. Изократни условия на елуиране са тези, при които по време на анализа не се променя съотношението между Фаза А и Фаза Б.

Необходим е съвсем малко опит, за да се очертае как се държат пиковете при промяна в % съдържание на Фаза Б в подвижната фаза (ПФ). Нека например разгледаме Фиг. 1. От горе на долу, всяка хроматограма е резултат на намаляване на % Фаза Б, от 65% до 50%. При намаляване на % Фаза Б (или увеличаване на % Фаза А), обичайно се наблюдават четири ефекта. Първо: пиковете се придвижват и времената им на задържане се увеличават. Второ: цялостната картина на разделянето показва тенденция към подобряване. Трето: пиковете стават по-широки, и четвърто – тъй като площта на пиковете е постоянна величина, пиковете стават и по-ниски. Този основен модел на промяна се случва при промяна в силата на подвижната фаза при което и да е обратнофазово разделяне на която и да е проба с всяка неподвижна фаза и система от разтворители. И да, за вас педанти – има някои изключения, но описаното е най-често срещаното поведение.

Фиг. 1: Изократно разделяне на проба нитроароматни съединения. Колона: 100 mm× 4.6 mm, частици 5μmC18; поток: 2 mL/min; температура: 25 ºC; Фаза А: вода; Фаза Б: метанол с %B показани на хроматограмите. Всички хроматограми са в един и същи мащаб. Симулирани хроматограми на база цитиран източник (3). Пикове: 1 = 2,6-dinitrotoluene, 2 = nitrobenzene, 3 = 2-nitrotoluene, 4 = 3-nitrotoluene, 5 = 2-nitro-1,3-xylene, 6 = 4-nitro-1,3-xylene, 7 = benzene.

В резултат на придобитото от подобни експерименти знание, в практиката широко се използва общоприета стратегия при разработването на методи. Стартираме с високо съдържание на органичния компонент на ПФ, напр. 90%, и правим стъпкообразни промени в силата на разтворителя - 90%, 80%, 70%, и т.н. — докато разделянето изглежда достатъчно добро. След това правим фините настройки с помощта по-малки стъпки.

Тази връзка между задържането и процентното съдържание на Фаза Б може да бъде обобщена с Правилото на 2.5, което гласи, че в общия случай фактора на задържане , k, ще се промени 2.5 пъти при 10% промяна в съдържанието на Фаза Б. Ние можем да видим как действа това правило при разглеждане на симулираните хроматограми на Фиг. 1., които са за проба от нитроароматни съединения и са базирани на данни, представени в литературата (3). Факторите на задържане са изчислени като k = ( t_R – t₀)/ t₀ , където t_R и t₀ са съотв. времето на задържане и мъртвото време на колоната. Използваната за Фиг. 1 колона е с размери 100 mm × 4.6 mm и анализа се извършва при поток на ПФ от 2 mL/min, което дава t₀ ≈ 0.5 min. Това се потвърждава от острия t₀ пик в началото на всяка хроматограма при време ~0.5 min. Знаейки t₀ , можем да изчислим, че последния пик при анализи с 65%, 60%, и 50% Фаза Б има стойности на k съотв. ~4.5, 7, и 19. Промяната от 60% на 50% Фаза Б е 10%, тъй че 2.5 × 7 = 17.5 ≈ 19, отчетено при хроматографиране с 50% Фаза Б. Тъй като връзката между log k и %B е линейна, 5% промяна в %B би трябвало да доведе до 1.6-пъти промяна в k. Отново това твърдение може да бъде потвърдено от Фиг. 1 чрез сравняване на анализа с 65% Фаза Б ( k ≈ 4.5 за последния пик): 4.5 × 1.6 = 7.2 ≈ 7 за анализ с 60% Фаза Б. (Тъй като описаното поведение малко варира в зависимост от молекулното тегло на анализираното съединение, ние често виждаме Правилото на 2.5 изразено като Правилото на 3, което е по-лесно за смятане наум.)

Въпреки, че основното наблюдение за подобряване на разделянето при по-ниско %-но съдържание на Фаза Б е вярно за изократни разделяния, поведението на някои специфични пикове може да се отклонява от това обобщение. Например и разделянето, и задържането, и широчината на пика за пикове 1 - 4 на Фиг. 1 се увеличават при по-ниски стойности на % Фаза Б. Но забележете поведението на пикове 5 - 7. При 65% Фаза Б, пиковете се елуират по ред и лесно се различават един от друг, без да са напълно разделени. При 63% Фаза Б, пикове 6 и 7 се сливат, и пик 7 се предвижва напред, за да се слее с пик 5 при 60%. Така, че при този пример, нито анализа при 63% Фаза Б, нито този при 60% Фаза Б не е по-добър , отколкото по-късия анализ при 65% Фаза Б. Отивайки към анализ с 50% Фаза Б, пик 7 се премества и от последно елуиращ се става първия елуиращ се от този тройка пикове. Подобно поведение, където селективността на хроматографската система, или относителната позиция на пика, се променя с промяна в % Фаза Б е достатъчно често срещана, и затова финото нагласяне на %B може да бъде мощно средство за преместване на пиковете един спрямо друг при изократни условия по време на разработването на аналитичния метод.

Нека обсъдим и влиянието на други променливи върху разделянето. Промяната в обемната скорост на подвижната фаза (flow rate) просто разширява или свива хроматограмата, но тя има малко или никакво влияние върху разделянето. Налягането в системата също се увеличава или намалява при промяна на скоростта на потока на ПФ. Увеличаването на температурата на колоната ще намали времето на задържане и ще генерира по-тесни и високи пикове, подобно на този ефект при увеличаване на % Фаза Б, но не толкова добре изразено.

Практическото правило за температурата гласи, че промяна от 1 °C в температурата ще промени задържането приблизително с 2%. Въпреки, че често се подценява, промяната в температурата може да доведе също до промени в селективност на системата при изократни разделяния. Увеличаването на дължината на колоната ще увеличи налягането и ще направи анализите по-дълги, но няма да промени относителните позиции на пиковете. По подобен начин намаляването на размера на частиците на пълнежа ще увеличи налягането и ще доведе до получаването на по-тесни пикове, но няма да промени времената на задържане на пиковете.

Тези различни примери за промяна формират основата на моето правило в хроматографията „Нищо не е магия“. Това правило казва, че промените в хроматограмата, причинени от промени на някакви фактори, обикновено се случват по непрекъснат начин. Например, ако вие промените състава на ПФ от 70% Фаза Б на 60% Фаза Б, ще забележите, че задържането нараства, тъй че можете да очаквате подобно увеличаване на задържането също и при промяна от 60% Фаза Б на 50% Фаза Б. Понякога зависимостите са логаритмични, а не линейни, но основния принцип важи. И това интуитивно качество на изократните разделяния е една причина те да бъдат толкова широко използвани и успешно прилагани – не ви трябва да разбирате теорията на хроматографията, за да получите приемливи резултати. По време на натрупването на вашия опит тези първично изградени интуитивни усещания обикновено ще ви водят в правилна посока .

Градиентите …

Интуитивната природа на изократните разделяния е много привлекателна, и е една от причините много хроматографисти да предпочитат изократните методи. Градиентните програми с промяна на % Фаза Б по време на анализа, може да изглежда много по-обезсърчително. Въпреки това, при подходящо сравняване на градиентни разделяния могат да се открият много от същите интуитивни резултати, както при изократните. Ключово за това е, че сравненията трябва да са наистина правилно подбрани. На представения пример с нитроароматни съединения (3), аз внимателно избирах градиентни условия за Фиг. 2, които да отговарят максимално на техните противоположни изократни елуирания от Фиг. 1. (Като страничен коментар, нека заявя следното: времето на градиента и неговия наклон са просто два различни начина да се опишат едни и същи условия на разделяне. Например, анализите на Фиг. 2 са 0 - 100% Фаза Б за различни времена. 5-минутния градиент може също да бъде изразен като 100%/5 min = 20%/min. По нататък в дискусията аз ще използвам времето на градиента)

Фиг. 2: Същите проби, като на Фиг. 1. Симулирани градиенти от 0– до 100% Фаза Б с време на градиента, показано на хроматограмата. Същия мащаб, като на Фиг. 1

Нашите общи заключения след разглеждане на Фиг. 2 са подобни  на тези от Фиг. 1. По-дългите времената на градиента увеличават задържането, подобряват разделянето, и генерират по-широки и по-ниски пикове. Забележете, че пиковете се елуират в същия ред при двете серии от разделяния

При 5-минутния и 65% B анализи, пиковете се елуират по номер. При 8-минутния и 63% B анализи, пикове 6 и 7 са слети, докато пикове 5 и 7 се сливат в 10-min и 60% B хроматограми. На 15-минутната хроматограма и тази с 50% B, всички пикове са разделени, в последователност 7-5-6 а последните 3 пика. От тези примери можем да видим, че финото настройване на времето на градиента може да бъде използвано за преместване на пиковете един спрямо друг, също както можем да постигнем този ефект при изократните разделяния.

Подобието на разделянията на Фиг. 1 и Фиг. 2 показва, че отдавайки нужното внимание, можете да получите приблизително същите резултати от градиентни и изократни разделяния, което означава, че механизмите на самото разделяне трябва да са доста сходни. На практика, поведението на аналитите при градиентната и изократна хроматография се унифицира от теорията на "линейната сила на разтворителя", каквото е и подзаглавието на източник (2) от цитираната литература. Единия начин на мислене за това е, че градиентната и изократната хроматография реално са едни и същи процеси, разглеждани от различни перспективи. Така, ако променим времето на градиента или неговия наклон, ще получим същите резултати, както ако променим % Фаза Б при изократно разделяне. По-дълъг или по-полегат градиент води до увеличаване на времето за анализ, подобрява разделителната способност, и до получаване на по-широки и по-ниски пикове, също както при намаляване % Фаза Б в изократния анализ. Това ни позволява да използваме нашите интуитивни разбирания от изократните разбирания към градиентите.

Какво да кажем за другите променливи, които накратко разгледахме за едно изократно разделяне: скорост на потока, температура, дължина на колоната и размер на частиците на пълнежа? Увеличаването на температурата на колоната при градиентно елуиране също намалява задържането (въпреки, че не толкова, като 2%/°C при изократен режим), води до по-ниско налягане, по-остри пикове и може да доведе до промяна в селективността, също както при изократно елуиране. По подобен начин намаляването на размера на частиците на пълнежа ще увеличи налягането в системата и ще генерира по-тесни пикове, без да се променя задържането. Противоположно на изократните разделяния, където промяната в скоростта на потока или дължината на колоната има логични и очаквани резултати, при градиентно елуиране такава промяна може да доведе до изненади – особено ако относителните позиции на пиковете се променят с промяната на един от двата фактора. Подобни изненади често са основата на заключения, че градиентите не са така "логични" както изократното разделяне. В следващите серии на "LC Troubleshooting" ние ще проверим тези и други разлики в поведението на аналитите при градиент и изократно хроматографиране

Правилото на 2.5 (или, ако предпочитате, Правилото на 3) за изократни разделяния дава прост начин за оценка на промяната в задържането при промяна на % Фаза Б. Задържането при градиентно елуиране не се описва по подобен прост начин. Въпреки това, едно основно наблюдение е, че при увеличаване времето на градиента, относителното задържане спрямо същото това време намалява. При 5-минутния градиент на Фог. 2 последния пик се елуира на 4.7 мин, или на 93% от общото време на градиента. И така неговото време на задържане намалява на 83%, 79%, и 72% при увеличаване времето на градиента на съотв. 8, 10 и 15 мин

Друга противоположност между градиентните и изократните разделяния е свързана с широчината на пиковете. При изократните анализи на Фиг. 1 може да бъде забелязано, че широчината на пиковете зависи от времето им на задържане, а не от състава на подвижната фаза. Елуиращите се първо пикове са тесни и с нарастване времето на задържане широчината на другите също се увеличава. Например пик 5 при 65% Фаза Б, пик 4 при 60% Фаза Б и пик 2 при 50% Фаза Б имат приблизително еднакви времена на задържане и широчина, докато на всяка хроматограма елуиращите се по-късно пикове са по-широки от тези в началото. Но при градиентните разделяния всички пикове в даден аналитичен ход имат приблизително еднаква широчина, която нараства с увеличаването на времето на градиента. Така, че всички пикове в 15-минутния анализ са по-широки от тези в 8-минутния, независимо от това, че всички пикове в двата анализа са с приблизително еднаква широчина. Този ефект може да бъде предимство за градиентните разделяния, тъй като по-тесните пикове означават по-високи пикове и оттам – по-ниски граници на откриване. Например пим 6, който се елуира на ~11 мин. при 15-минутния градиент на Фиг. 2, е много по-нисък от неговия „събрат“, елуиращ се на ~10 мин. при 50% Фаза Б на Фиг. 1 (всички мащаби са еднакви). Поради тази причина градиентите често са предпочитани за детектиране на малки, силно задържащи се пикове.

Изократно или с градиент

В началото на тази публикация споменах моето пристрастие към градиентното елуиране, но при сравняване на изократния анализ с 50% Фаза Б на Фиг. 1 с 15-минутния градиент на Фиг. 2 е очевидно, че изократното елуиране печели в този случай, като генерира по-добро разделяне за едно и също време. Ние бихме могли да очакваме такъв резултат, ако бяхме приложили Правилото 25/40% , обяснено в по-ранна "LC Troubleshooting" дискусия (1). Пиковете в 15-минутния градиентен анализ на Фиг. 2 заемат (10.9 – 8.3 min)/15 min = 26% от общото време на анализа, който резултат е много близо границата <25% от общото време, под която е много вероятно да бъдат предпочетени изократни анализи. Така че не е изненадващо, че за тази проба, изократното разделяне в по-добрия избор в сравнение с градиентните програми. Градиентите биват предпочитания режим на хроматографиране при по-големи разлики в задържането на първите и последните пикове.

Заключения

Изократните методи често са избирания от хроматографистите метод, тъй като позволяват интуитивното им разработване. Въпреки това сме виждали, че ако времето на градиента или неговия наклон се разглеждат в същия контекст като промяната на % Фаза Б при изократното разделяне, двата режима показват доста сходно поведение. По-дългите и по-полегати градиенти дават същите резултати като намаялването на % Фаза Б при изократен режим: по-големи времена на задържане, по-добро разделяне в основни линии, и по-широки и по-тесни пикове. Финото настройване на времето на градиента може да бъде използвано за получаване на малки, но желани промени в разделянето, също както при изократното разделяне.

В бъдещите "LC Troubleshooting" дискусии ще обсъдим как по-нанатък да разкрием някои от мистериите на градиентното елуиране, както и някои проблеми, които можем да срещнем по време на изпълнението на градиентни разделяния.

Използвана литература

(1) J.W. Dolan, LCGC North Am. 31(1), 30–35 (2013).

(2) L.R. Snyder and J.W. Dolan, High-Performance Gradient Elution, (Wiley, Hoboken, New Jersey, 2007).

(3) M.A. Quarry, R.L. Grob, L.R. Snyder, J.W. Dolan, and M.P. Rigney, J. Chromatogr. 384, 163–180 (1987).

John W. Dolan

Джон Долан е редактора на сериите "LC Troubleshooting" пише за списание LCGC повече от 25 години. Един от най-уважаваните професионалисти в индустрията, той е вицепрезидент и основен инструктор във фирмата LC Resources, САЩ. Джон Долан също така е член на редакционния консултативен съвет на LCGC.