01 декември 2010 година От Джон У. Долан
LCGC Северна Америка Том 28, брой 12, стр. 1022–1027
През 70-те години Rohrschneider прави задълбочено проучване на свойствата на различни разтворители (1). Наред с други неща, той показа, че в някои случаи, когато два разтворителя са смесени, могат да се получат свойства на трети разтворител. Това предполага, че някои подгрупи от всички възможни разтворители могат да се използват за химически цели. Приблизително по същото време, Лойд Снайдер се интересува от различните свойства на разтворителя, които са важни при разделянето в течната хроматография (LC), особено разделяне с обратна фаза
(2,3). От други изследвания той знае, че три свойства са от особено значение от гледна точка на селективността: киселинната, основната и биполярната природа на разтворителите. Снайдер е преизчислил данните на Роршнайдер въз основа на тези три свойства и ги е начертал в известния триъгълник - селективност на разтворителя. Подгрупа от тези данни е показана на Фигура 1, където всеки разтворител е нанесен на графиката според неговото съотношение на киселинни, основни и биполярни свойства. Точките показват централната тенденция на няколко класа разтворители, някои от които са етикетирани.
Фигура 1: Класификация на свойствата на разтворителя според тяхната кисела, основна и диполна природа. Адаптирано от справки 2 и 3.
По принцип три разтворителя - един със 100% кисел характер, един със 100% основен и един със 100% биполярност - ще бъдат разположени в крайните ъгли на триъгълника. Ако тези разтворители съществуват, трябва да сме в състояние да ги смесим в различни пропорции и да получим свойствата на разтворителите, които се намират в границите на триъгълника. Разбира се, такива разтворители не съществуват. Повечето разтворители имат смес от киселинни, основни и биполярни свойства, така че те се отдалечават от ъгъла и обикновено са далеч от краищата на триъгълника. Бихме могли да разгледаме други разтворители, които са близо до ъглите - разтворители, които показват предимно киселинни, основни или биполярни свойства. Например, карбоксилните киселини (RCOOH на Фигура 1) са доста кисели, амините - например триетиламин, са базични, а халогенираните разтворители - например дихлорометан, имат биполярни свойства. Теоритично при смесването на тези три разтворителя се очаква да получим разтворител с междинни свойства, но на практика това не би се получило, защото халогенираният разтворител не се смесва с останалите. Резултатът е две отделни фази – неприемливо за подвижна фаза!
Продължаваме да се движим към центъра на триъгълника, където търсим разтворители, които се смесват и имат господство над едно от желаните свойства. Например алкохолите, като метанол, имат някои киселинни свойства, етерите (тетрахидрофуран) имат основни свойства, а нитрилите (ацетонитрил) имат диполни свойства. Тези три разтворителя се смесват добре и образуват подмножество (защрихована площ фигура 1) в общия триъгълник. Би било хубаво да се заключи, че заради работата на Snyder, тези три разтворителя са избрани като разтворители за разделяне в обратнофазовта хроматография, но това би било малко самонадеяно. По времето, когато тази работа е приключила, тези три разтворителя вече са били най-популярните разтворители, но сега знаем защо са били избрани като най-ефективни. Повишените киселинни, основни и биполярни свойства на един разтворител в подвижната фаза могат да подпомогнат някои химични взаимодействия по-добре от други разтворители, така че трудно разделящите се вещества да се елуират добре.
Фигура 2: Подход на триъгълника на разтворител-селективност към развитието на метода.
Популярното приложение на триъгълника - селективност на разтворителя, се основава на набор от седем експеримента, използващи различни смеси от разтворители. Тази стратегия е в основата на системата Sentinal, въведена от DuPont и адаптирана от Perkin-Elmer като система за оптимизиране на разтворителите (PESOS). Тези продукти позволяват автоматична или полуавтоматична селекция на най-добрия разтворител за елуиране на определена проба. Концепцията на този подход е показана на фигура 2. Триъгълникът от разтворителите метанол, ацетонитрил и тетрахидрофуран (фигура 1) се приспособява към равностранен триъгълник за удобство. Приготвя се подвижна фаза (ПФ) с единият разтворител, като неговата концентрация се регулира с вода или буфер, за да се получи задържане в определен диапазон, което да постигне желаното разделяне - например 50:50 - метанол : буфер. След това се приготвя ПФ с вторият разтворител, която се нагласява, така че да се получи подобно общо задържане – например 40:60 ацетонитрил - буфер. Третата ПФ – разтворител : буфер, трябва да има същото задържане - например 30:70 тетрахидрофуран - буферна смес. Чрез подходящо регулиране на съотношенията между органичен разтворител и буфер, трите подвижни фази следва да дават много сходни времена на задържане. Това са експерименти № 1, 2 и 3 в ъглите на триъгълника (фигура 2). Следва пригорвянето на смеси в съотношение 1: 1 от първоначалните ПФ, за да се генерират опити № 4, 5 и 6, намиращи се върху страните на триъгълника (фигура 2). Накрая сместа от първоначалните три подвижни фази в съотношение 1: 1: 1 формира централния експеримент (№ 7). Данните за задържане от всеки от тези експерименти се въвеждат в програмата за оптимизация и резултатите от условията на експерименталните точки могат да бъдат изчислени, за да се намери най-доброто възможно разделяне, често кватернерна смес от метанол, ацетонитрил, тетрахидрофуран и буфер.
Фигура 3: Симулирани частични хроматограми за различни смеси от метанол, ацетонитрил и тетрахидрофуран с буфер. Хроматограмите са разположени, така че да съответстват на триъгълника от фигура 2.
Алтернативно, седемте хроматограми могат да бъдат отпечатани и изложени в същия триъгълник (фигура 2) с визуална интерполация, за да се идентифицират най-добрите условия на разделяне. Пример за този подход е показан със симулираните хроматограми на фигура 3. Изпълнението на метанол-буфер (проба 1) разделя само четири пика на петкомпонентната смес - последните два пика се сливат. Изпълнението на ацетонитрил-буфер (проба 2) почти отделя последните два пика, но вторите два са обединени и обърнати. Тетрахидрофуран-буферът (проба 3) също има своите проблеми - последните две съединения са добре разделени, но вторите две все още са слети. Разумно е да се предположи, че условията на междинната мобилна фаза ще дадат междинни разделяния, когато състоянието на подвижната фаза се променя. Ако правим тези опити един по един и разглеждаме резултатите преди да продължим, може да пропуснем № 5, защото е очевидно от проба 1 и 2, че междинното разделяне на последните два пика няма да бъде по-добро от това за бинарни подвижни фази. Същата прогноза може да бъде направена за вторите два пика в проба № 6 на базата на проби № 2 и 3. При проба № 4 - 50:50 смес от мобилните фази, използвани в проби № 1 и 3, е в състояние да раздели всичките пет пика до базова линия. Четвъртичната смес в съотношение 1: 1: 1 от проби № 1, 2 и 3, която формира проба № 7, също е незадоволителна.
Този подход с триъгълника на разтворителите беше доста популярен при развитието на методи през 70-те и 80-те години. Беше доста интуитивен за използване и генерираше полезни методи. Той е еднакво добър за разработването както на изократни, така и на градиентни методи. Подвижните фази често включват всичките три разтворителя плюс вода, а колкото повече компоненти се съдържат в подвижната фаза, толкова повече неща могат да се объркат. Това, съчетано с по-малко възпроизводимата природа на колоните по това време, водеше до методи, които често се нуждаеха от непрекъснато модифициране, за да продължат да работят ефективно. Както ще видим следващия месец в "LC Troubleshooting" по-задълбоченото разбиране на задържането с обратна фаза доведе до въвеждането на техника за оптимизация силата на разтворителя, която до голяма степен замени триъгълника на разтвотителите като най-популярния подход за разработване на метод. Но само защото не е толкова популярен днес, не означава, че трябва да отхвърлим подхода на триъгълника на разтворителите - той е мощен инструмент, който може да помогне за решаването на трудни проблеми, особено след като простите техники не са успели.
Друга информация
Видяхме как триъгълникът селективност на разтворителите ни помага да разберем защо ацетонитрил, метанол и тетрахидрофуран са се превърнали в допълващи и предпочитани разтворители за LC фази в обратно фазовата хроматография. Триъгълникът може да послужи като организационен инструмент за използването на даден тип разтворител, с помоща на който да регулираме разстоянието между пиковете в хроматограма.
Има и други приложения за триъгълника на разтворителя.
Можем да използваме триъгълника на разтворителя, за да направим мъдър избор при използването на допълнителни разтворители за тестване. Например, ако установим, че метанолът в подвижната фаза не ни дава необходимото разстояние от пиковете, може да се изкушим да опитаме друг алкохол - може би етанол или пропанол. Но свойствата на всички тези алкохоли ги карат да се намират в долния ляв ъгъл на триъгълника. Това подсказва, че е малко вероятно да намерим драматично различни хроматографски свойства чрез преминаване към различен алкохол. Ще бъде много по-добре да се преместим в една съвсем различна част на триъгълника, ако целта ни е да използваме селективността на разтворителя, за да преместваме пиковете в хроматограмата. От друга страна, може да има други причини, поради които можем да преминем от един алкохол към друг. Например, по-големите алкохоли, като пропанол, са склонни да бъдат по-малко денатуриращи към биомолекули, от колкото метанола – очакват се подобни, но не идентични, хроматографски свойства при извършването на тази промяна. Друг пример, можем да открием при етерите, където основните свойства на тетрахидрофуран са благоприятни за отделно разделяне, но неговите други свойства, като относителна нестабилност и висока абсорбция на UV, го правят неподходящ за някои приложения. Възможно е успешно да се замести с друг етер, като метил трет-бутил етер (МТВЕ), който обаче не се смесва напълно с вода.
Друго приложение на триъгълника на разтворителя е да се идентифицират алтернативни разтворители на подвижната фаза, ако намирането на дадения разтворител е ограничено. В горния пример за алкохол видяхме, че свойствата на различните алкохоли са достатъчно сходни и е малко вероятно промяната в алкохолния тип да е предимство, когато се опитва да се промени селективността. Това предполага, че бихме могли да преминем от един алкохол към друг, ако е необходимо по други причини. Например, ако намирането на метанол с HPLC качество стане трудно по някаква причина, бихме могли да преминем към етанол с надеждата да получим подобно разделяне. Поради различни икономически, политически и практически съображения (виж референция 4) ацетонитрилът с HPLC качество е станал доста скъп през последните няколко години. Би било хубаво да се намери друг разтворител, който да има подобни свойства и да се използва като алтернатива. За съжаление, в диполния ъгъл на триъгълника, които отговарят на това изискване, няма налични разтворители, така че ние оставаме с ацетонитрил. Ако е необходим ацетонитрил, за да се получи желаното разделяне и няма алтернативни разтворители, трябва да подходим към проблема от различен ъгъл. Можем да използваме колона 150 mm × 4,6 mm до колона 150 mm × 2,1 mm. Намаляването на диаметъра на колоната ще ни позволи да намалим скоростта на потока с коефициент 5 и да получим същото време на задържане - например, от 1 mL / min до 0.2 mL / min. Това би намалило и консумацията на ацетонитрил с пет пъти. Или бихме могли да преминем от колона от 150 mm × 4,6 mm, напълнена с 5-µm частици, към колона 100 mm × 4,6 mm, пълна с 3-μm частици. И двете колони ще генерират приблизително 10 000 теоритични тарелки с реални проби, така че колоната от 100 mm трябва да намали времето за работа с една трета - 15-минутен цикъл ще спадне до 10 минути, съответно спестява разтворител. Можем да комбинираме и двете промени като преминем от колона 150 mm × 4,6 mm, 5 µm към колона 100 mm × 2,1 mm, 3-µm, с което да намалим разхода на разтворител с 5 × 3 = 15 пъти. Разбира се, ако тези промени бъдат направени, може да се наложи да направим някои други корекции, като например намаляване на количеството инжектирана проба или регулиране на връзките в системата, за да се намали допълнителния мъртъв обем.
Заключения
Триъгълникът за селективност на разтворителите помага да се намали броят на възможните разтворители, които да бъдат полезни по време на разработването на LC метод. Той също така ни дава организационна рамка, когато изследваме селективността на разтворителите като средство за разрешаване на трудни за разделяне аналити. Не на последно място, можем да разберем някои предимства и недостатъци за алтернативните разтворители, ако искаме да направим промяна.
Джон У. Долан
Редактор на LC за отстраняване на неизправности John Dolan пише "LC Troubleshooting" за LCGC повече от 25 години. Един от най-уважаваните професионалисти в индустрията, Джон в момента е вицепрезидент и главен инструктор за LC ресурси, Walnut Creek, Калифорния. Той е и член на редакционния съвет на LCGC. Директна кореспонденция за тази колона на "LC Отстраняване", LCGC, Woodbridge Корпоративен Плаза, 485 Route 1 South, Сграда F, Първи етаж, Iselin, NJ 08830, e-mail John.Dolan@LCResources.com
За непрекъсната дискусия за решаване на проблеми с LC с John Dolan и други хроматографи, посетете дискусионната група по Хроматографския форум на http://www.chromforum.org/.
Източници:
(1) L. Rohrschneider, J. Chromatogr. 22, 2 (1966).
(2) L. Snyder, J. Chromatogr. 92, 223-230 (1974).
(3) L. Snyder, J. Chromatogr. B 689, 105, (1997).
(4) R.E. Специалности, LCGC Северна Америка 27 (6), 458–471 (2009)
