От Dwight R. Stoll / LCGC Северна Америка
Том 36, брой 10, стр. 746–751

Какви типове смесители са необходими при различни типове LC помпи? Необходими ли са различни смесители за различни приложения?

В някои теми, за които съм писал през изминалата година, аз се опитах да насоча вниманието към аспектите на нашата практическа работа с LC, които според мен често са недооценени - например стойността на използването на вградени филтри за мобилна фаза и най-добрите практики за намаляване на замърсителите при използване на LC – MS.

Има и други теми, които набелязах при разговорите с хората за работата им в LC, като повечето са недоразумения, погрешни схващания и митове. Този месец избрах да се занимая с тема от този вид, фокусирана върху смесването на подвижни фази и смесителите. Мисля, че има някакво объркване сред потребителите на LC за това какво се случва, когато комбинираме два (или повече) различни потока в LC системи, както и кога имаме необходимост от смесители. Надявам се, че чрез тази дискусията ще вникнем по-дълбоко в тази тема.

Защо се нуждаем от смесители в LC системата?

Обща конструкция на помпата

По-голямата част от използваните днес LC помпи могат да се характеризират с един от двата дизайна, показани схематично на фигура 1. Тези схеми са обсъдени в раздела "Отстраняване на проблеми в LC" (1) и има добри образователни ресурси, за да научите повече за тях другаде (вижте www.chromacademy.com). Читателите, които се интересуват от повече подробности, ще намерят обширно обсъждане на съвременните помпи от Франк Щайнер в "The HPLC Expert II", редактиран от Stavros Kromidas (2). В нашата дискусия ще се ограничим до определено ниво на детайлност, за да оценим защо и кога е необходим "смесител". Конструкцията на Фигура 1а обикновено се нарича смесваща система за високо налягане, което означава, че всяка от съставните части на подвижната фаза се изтласква първоначално с достатъчно сила, за да отговори на входното налягане на колоната, и след това тези потоци се обединяват във флуидна връзка (наричана тук точка на сближаване). Тези системи обикновено са с двоични помпи, което означава, че те имат две независими помпи с високо налягане, които могат да доставят два различни разтворителя до точката на сближаване под високо налягане. Конструкцията, показана на фигура 1Ь, обикновено се нарича смесителна система с ниско налягане, което означава, че два или повече флуида се събират в точката на сближаване под ниско налягане, и след това единичният поток от комбиниран флуид се нагнетява от една помпа за високо налягане, отговаряща на входното налягане на колоната. Основното предимство на смесването под високо налягане (Фигура 1а) е, че времето необходимо за промяна в състава на разтворителя (при градиентно елуиране) е много по-кратко, отколкото при смесителни системи за ниско налягане. Ние наричаме това време на забавяне на градиента и ще обсъдим това по-късно в статията. От друга страна, основното предимство на смесителната система с ниско налягане, илюстрирано на фигура 1б е, че те обикновено идват с по-ниска покупна цена, просто защото има само една помпа с високо налягане, вместо две. Фактът, че този тип помпа може да работи с трикомпонентни (три течности), а дори и с четвъртични (четири течности) подвижни фази, също може да бъде голямо предимство за някои приложения.

Фигура 1: Блокови диаграми за двата най-често използвани модела на HPLC помпи днес: а) бинарна помпа за смесване под високо налягане; и b) кватернерна помпа за смесване под ниско налягане.

Да си представим сливането на две течности в помпата

Сега, на въпроса: Защо имаме нужда от смесител? Първо, полезно е да се дефинира значението на смесител в контекста на тази статия. Тук ще използваме термина смесител, за да се опише всяко устройство, което умишлено се използва в LC система за смесване на две или повече течности. Разбира се, в реалните LC системи има много елементи на системата, които подпомагат смесването на подвижната фаза (и пробата), независимо дали това е предназначението на този елемент. Например, смесване може да се случи в права капилярна връзка, а в голяма степен смесване се случва и във всички хроматографски колони (въпреки че са проектирани да го предотвратят!). Начините по които различни потоци от флуиди се сливат в LC система, могат да бъдат много различни. Тук ще разгледаме два сценария: 1) конвергенция в помпа за смесване под високо налягане (Фигура 1а); и 2) конвергенция в смесителна помпа с ниско налягане (Фигура 1b). В следваща статия ще разгледаме сливания на извадката и мобилната фаза, когато проба се инжектира в колона (Фигура 2, сценарий 3). Фигура 2 илюстрира основните различия между тези три сценария по отношение на това как два флуида ще се слеят. В първия сценарий двата флуида се доближават много близо до една капиляра с малък диаметър, така че молекулите на флуид А трябва да пропътуват много кратко разстояние (най-много стотици микрометра) чрез дифузия, конвекция, или и двете, за да постигнат действително смесване с молекулите на флуида Б. В този случай има доста разнороден поток, който постъпва в капилярата, тъй като преминава през завои, връзки с клапани и други фитинги. Този неуправляем поток може да осъществи смесване на два потока от флуиди, ако те действително са последователни във времето, както е показано в сценарий 1 на Фигура 2. Но този идеален случай никога не се постига достатъчно прецизно, когато се използват помпи с бутални механизми (по-долу ще разгледаме това по-подробно).

Фигура 2: Идеализирано представяне на различните начини, по които два флуида се събират при различни обстоятелства в LC системи: 1) конвергенция в бинарна помпа за смесване при високо налягане; 2) конвергенция на изхода на клапан за дозиране на разтворител в смесителна помпа с ниско налягане; 3) конвергенция, когато пробата се инжектира в поток от подвижна фаза, която ще пренесе пробата в LC колоната.

Преминавайки към сценарий 2 (фигура 2), виждаме, че начинът, по който течностите се смесват тук, е напълно различен от сценария на фигура 1. При смесването под ниско налягане състава на подвижната фаза се определя от продължителността на отваряне и затваряне на електромагнитни клапани, които са монтирани на входящите линии на пропорционалния клапан. Например, когато желаният състав на подвижната фаза е в съотношение 25 към 75 обемни процента (както е показано на фигура 2), клапан А може да се отвори за 150 ms, последвано от отваряне на клапан B за 450. Тези две събития представляват един цикъл на клапана, който позволява на помпата да изтегли пакет от смес в съотношение 25 към 75 обемни процента. Важна разлика между сценарии 1 и 2 е, че в сценарий 2 течностите се събират последователо, докато в сценарий 1 двата потока се събират паралелно. При сценарий 2, за да се произведе хомогенна смес, молекулите на флуид А трябва да изминат относително дълго разстояние, за да се смесят с молекулите на флуид В (фигура 2). Това разстояние зависи от редица фактори, включително дебит, състава на сместа и диаметъра на капилярата, свързваща клапаните за дозиране на разтворителя към помпата с високо налягане. Поради тази причина помпите за смесване под ниско налягане изискват смесители с по-големи обеми, за да се получи желаната хомогенна смес. Има един допълнителен и важен детайл, свързан със сценарий 1, който също е от значение. Повечето помпи, които имат конструкция за смесване под високо налягане, използват двойни бутала във всяка помпа с високо налягане. Въпреки че има много варианти на този дизайн (2), основната идея е, че едно бутало изтегля течност от бутилка с разтворител, докато другото бутало избутва течността под високо налягане към колоната. Тези бутала акумулират и изместват ограничен обем, така че в края на хода на буталото, движението на двете бутала се обръща, което налага използването на възвратен клапан, за да се предотврати връщанто на поток от подвижна фаза обратно от към колоната. Въпреки че всичко това работи много добре, краткосрочните отклонения в потока от всяка помпа с високо налягане са много трудни за избягване. Един прост пример е показан на фигура 3 - когато потокът от течност А е временно по-нисък, така че в края на цикъла на буталото, състава на комбинираната течност ще бъде обогатен с флуид В и обратното. В случаите, когато компонентите на подвижната фаза са прозрачни за детектора (например, вода в случай на UV детекция, или метанол при флуоресценция), ние сме слепи за тези отклонения в състава на подвижната фаза. Обаче, ако детекторът е дори малко чувствителен към тези промени (например, когато се използва мравчена киселина във вода с UV детекция при 214 nm, или ацетонитрил и вода при индекс на пречупване), тези отклонения ще бъдат открити като вълнообразен модел в изходно ниво. Тук отново, както беше при смесителните системи с ниско налягане е необходим смесител, за да се движат флуидните молекули от една обогатена област на потока към друга (фигура 3). И така, въпреки че в идеалния случай е необходимо много малко смесване при системите под високо налягане, работа на помпата налага използването на смесител за изглаждане на краткосрочните изменения в състава на подвижната фаза (Фигура 2, сценарий 1).

Фигура 3: Илюстрация на ефекта от противоречивия поток от отделни помпи за високо налягане в бинарна система за смесване при високо налягане върху изменението на състава на подвижната фаза във времето и ефекта върху базовите линии на детектора.

Влияние на лошото смесване върху хроматографските резултати

Двете основни практични последствия от лошото смесване са: шумни базови линии на детектора и слаба повторимост на времето на задържане на аналита. Сравнението на детекторните сигнали при типични работни условия с и без смесване илюстрира как степента на съзнателното смесване може да има голям ефект върху наблюдавания сигнал. Фигура 4 показва абсорбционни сигнали от UV детектор при изпомпване на 25 към 75 обемни проценти 100% ацетонитрил и 50 mM амониев формиат във вода от смесителна помпа под високо налягане - с и без монтиран смесител. Ефектът на смесителя е да изглади краткосрочните вариации в състава на подвижната фаза, което очевидно прави базовата линия на детектора с много нисък шум. Лесно е да си представим как тези вариации без смесване могат да доведат до лоша точност и при времето на задържане.

Фигура 4: Сравнение на UV абсорбционни сигнали (220 nm), получени без инсталирана колона, докато се изпомпва 25:75 ацетонитрил към 50 mМ амониев формиат при 0.5 mL / min. Помпата е бинарна смесителна система с високо налягане (Agilent 1290, Infinity II). Изходът от точката на сближаване е свързан директно към детектора със 100 cm × 120 µm i.d. тръба PEEK, със и без монтиран миксер.

Кога трябва да обмислим използването на различен смесител?

Както и при много други решения за разработване на методи в LC, анализаторът трябва да прецени дали смесителя, който се използва дава добри резултати при прилагане на метода. Някои приложения са значително по-взискателни от други в това отношение. Особено предизвикателство е използването на трифлуорооцетна киселина (TFA) в елуентите при обратнофазови хроматографски колони и градиентно елуиране. Такива условия са често използвани за разделяне на комплексни пептидни смеси, както и на смеси от хидрофилни аминосъдържащи съединения. Това е труден случай, защото TFA абсорбира UV светлина при същата дължина на вълната, която се използва за детектиране на пептидите (най-често 214 nm), но и самата TFA се задържа слабо от колони с обратна фаза във богати на вода подвижни фази. В този случай краткосрочните вариации в подвижната фаза, като тази показана на фигура 3, могат да доведат до вълни на TFA, движещи се през колоната като импулси от богата на ацетонитрил подвижна фаза, причиняващи локално намаляване на задържането на TFA и преходно увеличаване на елуирането на TFA от колоната. Фигура 5 показва сравнение на базовите линии на UV абсорбция, наблюдавани при тези условия, с два различни смесителя. Този пример показва ползата от използването на по-голям смесител, тъй като базовата линия става много по-гладксе изглажда.

Фигура 5: Сравнение на UV абсорбционни сигнали (214 nm), получени с различни смесители. Използвана е същата помпа, както на фигура 4, но сега е използвана колона (30 mm х 2.1 mm i.d. Agilent SB-C18) и градиентно елуиране. Разтворител А е 0.1% трифлуорооцетна киселина във вода, разтворител В е 0.1% трифлуорооцетна киселина в ацетонитрил и градиентът протича от 2 до 40% В за 4 минути.

Достатъчно смесване?

Едно нещо, което не съм засегнал конкретно в тази статия е дизайнът на смесителя. Съществуват твърде много различни дизайни, които се използват, за да се опишат в една статия. Въпреки че някои модели несъмнено са по-добри от други, е разумно, в повечето случаи, да се придържате към дизайна, поддържан от производителя на вашата помпа. В случаите, когато производителят на помпата има ограничени предложения за смесители е възможно да се комбинират помпи и смесители от различни произвоители, тъй като всички те са пасивни устройства и нямат подвижни части. Читателите, които се интересуват от повече подробности, свързани със специфични конструкции на смесители, ще намерят доста информация по този въпрос в книгата на Кромидас (3).

До тук разгледах какво е предимството при използване на смесител с голям обем, но е важно да се разберат и последствията от добавянето на значителен обем към системата. Всеки елемент, който добавя обем по пътя на потока от точката на сливане в помпата и LC колоната, ще увеличи времето на забавяне на градиента. Това е разликата между времето, когато е направена промяна в състава на мобилната фаза в точката на сближаване и времето, когато тази промяна достига до входа на колоната. Например: добавя се смесител с обем от 35 uL в система, който работи при 1 mL/min. - времето на забавяне на градиента е само 0,035 min (~ 2 s), но добавянето на по-голям обем от 200 µL към система, работеща при 100 µL/min, ще има много по-голям ефект, тъй като това ще увеличи времето на забавяне на градиента с 2 min! Ефектите от такава голяма промяна ще бъдат многобройни, когато се използва градиентно елуиране и трябва да се прави много внимателно.

Кратък списък с промени, които трябва да се очакват: 1) значителни (абсолютни) увеличения на времената на задържане; 2) значителни промени в селективността (относително задържане) и 3) увеличаване на времето за анализ поради по-бавното пристигане на градиентното начало в колоната и по-дългото необходимо време за промиване със силен разтворител.

Заключение

Изпълнението на LC помпи е подобрено съществено по отношение на прецизността и точността на състава на подвижна фаза, в сравнение с това, което е било възможно в ранните дни на съвременната LC. Това е довело до значително намаляване на обема на смесителя и съпътстващото намаляване на времето за забавяне на градиента, което е много полезно за увеличаване на производителността на LC методите, намаляване на използвания разтворител и използването на по-ефективни двумерни LC методи. Въпреки това, дори и при най-добрите налични помпи, все още са необходими смесители, а оптималният размер на смесителя варира в известни граници. Детайлното вникване в това, защо са необходими смесители и кога е необходима промяна на смесителя, трябва да доведе до по-добра производителност на метода и подобряване на преносимостта на методите в бъдеще.

Източници

(1) J.W. Dolan, LCGC North Am. 34, 400–407 (2016).

(2) F. Steiner, in The HPLC Expert II: Find and Optimize the Benefits of Your HPLC/UHPLC, S. Kromidas , Ed. (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2017), pp. 101–170.

(3) S. Kromidas, Ed., The HPLC Expert II: Find and Optimize the Benefits of Your HPLC/UHPLC (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2017).