Органично модифициране

Фазите в обратнофазовата хроматография обикновено съдържат вода и по-малко полярен разтворител (органичен модификатор), както и други добавки като буфери, киселини и основи. При този тип хроматография водата е по-слабият разтворител, докато органичния компонент е по-силният. Следователно съотношението между двата компонента в подвижната фаза може да се използва като средство за контрол на задържането на аналитите.

Цяла гама от органични разтворители са подходящи за модифициране на фазите в обратнофазовата течна хроматография, но в практиката само няколко от тях се използват често. При избора на органичен разтворител трбва да се вземат предвид неговите характерни свойства като полярност, разтворимост във вода, вискозитет, UV спектър на поглъщане и безопасност при работа. Всеки разтворител има предимства и неодостатъци, които следва да се обмислят преди неговото използване. Например тетрахидрофуранът (THF) и изопропанолът (IPA) предлагат много голяма сила на разтваряне, което може да бъде полезно. Високият вискозитет на изопропанола обаче ограничава неговото приложение, понеже води до високо обратно налягане и понижава неговата ефективност. От друга страна тетрахидрофуранът може да увреди уплътненията на помпите, капилярните връзки от PEEK и фитингите. Освен това се налага използването на стабилизиращ агент, за да се предотврати образуването на пероксид. Ацетонът е икономична алтернатива на ацетонитрила със сравнима сила на разтваряне, но високите нива на UV абсорбция ограничават неговото приложение за някои методики.

През годините ацетонитрил и метанол са се наложили като най-предпочитаните органични вещества за модифициране на фазите при обратнофазова течна хроматография. Двата разтворителя напълно се смесват с вода и са съвместими с използваните добавки и буфери за подвижните фази (при допълнително внимание, когато органичният компонент е с висок процент). И двете вещества имат своите предимства и недостатъци, а изборът на едното пред другото често зависи от приложението. Например цената на аценонитрила е значително по-висока, но пък той има по-нисък праг на UV абсорбция от метанола (190 nm срещу 205 nm), което го прави по-подходящ за приложения, в които се търсят ниски нива на UV детекция. Важно тук е да се отбележи, че при течната хроматография винаги трябва да се използват разтворители с гарантирано HPLC или дори по-високо качество. Друга важна разлика е, че водните разтвори на ацетонитрил имат по-ниска вискозност от тези на метанола. Това означава, че тези фази ще генерират значително по-малко налягане при преминаване през аналитичната колона (Фигура 1). Това обикновено се смята за предимство, понеже натоварва по-малко хроматографската система и аналитичната колона и съответно увеличава техния работен ресурс. Освен това дава възможност за оптимизиране на метода като се увеличи скоростта на потока, за да се постигне по-кратко време за анализ.

Фигура 1: Експериментално определяне на работното налягане при различни съотношения на метанол и ацетонитрил с вода на аналитична колона Avantor^® ACE^® Excel 2 C18, 100 x 3.0 mm (поток: 0.43 mL/min, температура: 30ºC).

Сила на разтваряне

Ацетонитрилът има по-голяма сила на ратваряне от метанола, следователно при обратнофазовата хроматография може да се очаква по-кратко време на задържане при равни пропорции на органика и вода в използваните фази (Фигура 2). В този пример при разделянето на неутралните аналити се налюдава около 1.7 пъти по-дълго време на задържане когато се използва подвижна фаза от метанол/вода. В практиката е възможно чрез увеличаване на концентрацията на метанола да се постигне разделяне близко до резултата от Фигура 2А. За целта трябва да се постигне сила на разтваряне близка до тази на фазата ацетонитрил/вода. За някои приложения този подход може да е успешен, но винаги трябва да се следи за промени в селективността и поредността на пиковете.

Фигура 2: Сравнение на разделянето на неутрални аналити при използване на мобилна фаза А) 75:25 v/v ацетонитрил/вода и В) 75:25 v/v метанол/вода на аналитична колона Avantor^® ACE^® Excel 2 C18, 100 x 3.0 mm (поток: 0.43 mL/min, температура: 30ºC, обем на инжекцията: 0.5 µL, детекция: UV 254 nm).

Селективност

Едно от най-големите предимства да разполагаме едовременно с ацетонитрил и метанол е, че те са разтворители с различни свойства. И двете съединения са полярни, но метанолът е протичен, докато ацетонитрилът е апротичен и има по-изразен диполярен характер. Това означава, че органичният модификатор на мобилната фаза може да има голям ефект върху селективността в хроматографията. Ето защо промяната на този цомпонент от мобилната фаза се смята за много полезен инструмент при разработката на методи.

Фигура 3 показва едно и също градиентно разделяне при използване на метанол и ацетонитрил за модифициране на подвижната фаза. В този случай се наблюдават няколко лоши разделяния и размествания в поредността на пиковете при използването на ацетонитрил. Когато се приложи същия метод с метанол се постига по-добра селективност и всички компоненти на пробата са напълно разделени. Ето защо и двата разтворителя трябва да се имат предвид при разработка на нови методи, за да може да се постигне оптимално разделяне.

Фигура 3: Градиентно разделяне на 17-компонентна тестова смес при използване на А) ацетонитрил и В) метанол за модифициране на мобилната фаза. Аналитична колона: Avantor^® ACE^® 3 C18-AR 50 x 2.1 mm, поток: 0.6 mL/min, температура: 40ºC, градиент: 3-100% В за 6.5 min, детекция: UV 214 nm.

Тъй като метанолът и ацетонитрилът са напълно смесими един с друг, те може да се използват и едновременно, за да се постигне допълнително подобряване на резултатите. Фигура 4 показва градиентно разделяне на базични аналити, при които само ацетонитрил или метанол използвани като органичен компонент в мобилната фаза не могат да осигурят пълно разделяне. Когато се използва само метанол пикове 5 и 6 не се разделят. При работа само с ацетонитрил пикове 3 и 4 остават неразделени. Когато обаче се използват и двата разтворителя заедно с вода в подвижната фаза е възможно да се постигне пълно разделяне на всичките 7 компонента.

Фигура 4: Смесване на органични разтворители за постигане на градиентно разделяне на 7 базични аналита. 20 mM KH₂PO₄ pH 2.7 (aq) се използва като компонент на водната фаза за линия А и различни смеси от органика и вода за линия B (виж означенията горе). Аналитична колона Avantor^® ACE^® 3 C18, 150 х 4.6 mm, поток: 1 mL/min, температура: 35ºC, градиент: 5-70% В за 11 min, детекция: UV 205 nm. Проба: 1. бензиламин, 2. прокаинанид, 3. тербуталин, 4. салбутамол, 5. амилорид, 6. триметилбензиламин, 7. пиндолол.

Заключение

Ацетонитрилът и метанолът имат своите предимства и недостатъци като органичен компонент на мобилната фаза в обатнофазовата течна хроматография. Изборът на единия от двата разтворителя зависи от самото приложение. Вероятно най-важната характеристика на двата разтворителя е, че те предлагат много различна селективност, което ги превръща в незаменим инструмент при разработка на нови методи.

*Статията е първоначално публикувана в Chromatography Today, Брой 12, издаден 1, 2019г.